Науки о жизни
0

структурные и функциональные особенности лимфатических сосудов в ЦНС

by editorИюнь 9, 2015

Antoine Louveau,  Igor SmirnovTimothy J. KeyesJacob D. EcclesSherin J. RouhaniJ. David PeskeNoel C. DereckiDavid CastleJames W. MandellKevin S. LeeTajie H. Harris & Jonathan Kipnis

Одним из свойств центральной нервной системы является отсутствие классической системы лимфатических дренажей.  И хотя в настоящее время принято считать, что центральная нервная система подвергается постоянному иммунному надзору, осуществляемому в пространстве твердых мозговых оболочек, механизмы, регулирующие вход и выход иммунных клеток из ЦНС, всё ещё остаются плохо изученными. В поисках  шлюзов для  входа  и выхода Т- клеток  из мозговых оболочек, мы обнаружили функциональные лимфатические сосуды, пронизывающие синусы твердой мозговой оболочки. Эти структуры имеют все молекулярные метки лимфатических эндотелиальных клеток, способны переносить как жидкости, так и клетки иммунной системы из спинномозговой жидкости, и соединены с глубокими шейными лимфатическими узлами. Уникальное расположение этих сосудов, возможно, препятствовало их открытию вплоть до сегодняшнего дня, тем самым подтверждая, в некотором роде, давнишнюю концепцию  отсутствия лимфатических сосудов в центральной нервной системе. Открытие лимфатической системы в ЦНС  может потребовать переоценки основных гипотез в нейроиммунологии и проливает новый свет на этиологию нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний, связанных с дисфункцией иммунной системы.

Стремясь определить маршруты,  ответственные за рециркуляцию глубинных иммунных клеток, мы исследовали менингеальные пространства и клетки, заполняющие эти пространства. Во-первых, был изготовлен  препарат  оболочек головного мозга мыши (Рис. 1А), который был окрашен иммуногистохимическим методом в поисках  эндотелиальных клеток (Расширенные данные, рис. 1А), Т-клеток  (рис. 1Б) и клеток, экспрессирующих основной комплекс гистосовместимости  II (MHCII)  (Расширенные данные, рис. 1Б). Маркировка этих клеток показала ограниченное распределение иммунных клеток по  менингеальным пространствам, с высокой концентрацией клеток, найденных в непосредственной близости от пазух твердой мозговой оболочки (рис.1В. Расширенные данные  рис. 1Б-Г)

Синусы твердой мозговой оболочки направляют  кровь,  как из внутренних, так  и из внешних мозговых вен, во внутренние яремные вены. Была определена точная локализация  Т-лимфоцитов вокруг синусов, с целью исключить возможность артефактов, вызванных неполной внутрисердечной перфузией. Коронарные срезы твердой мозговой оболочки (рис. 1В, Г) были окрашены на CD3e (Т-клетки) и CD31 (эндотелиальные клетки). Действительно, подавляющее большинство Т-лимфоцитов в районе синусов находилось вне просвета. (Рис. 1Д). Чтобы подтвердить этот вывод, мышам вводили внутривенно  DyLight 488 с лектином (прим. – флуоресцентный краситель,  цвет зеленый) или флуоресцентные анти-CD45 антитела  до эвтаназии, и внепросветная локализация была подтверждена (Расширенные данные, рис.Д,Е), также был произведен количественный учет (рис. 1Е). Неожиданно, часть Т-клеток (и, MHCII-экспрессирующих клеток) оказалась линейно выстроенной поблизости к  CD31-экспрессирующим структурам  вдоль синусов (только несколько клеток были замечены в менингеальных сосудах похожего диаметра), что предполагает  уникальную функцию этих околосинусовых сосудов(рис. 1Ж-И).

В дополнение к сердечно-сосудистой системе, лимфатические сосуды представляют собой отдельную и важную сосудистую сеть в организме.  Воодушевленные  нашими наблюдениями,  мы протестировали околосинусовые  сосуды  на предмет маркеров, связанных с лимфатическими эндотелиальными клетками (LEC). Весь объем мозговых оболочек взрослых мышей подвергся иммуноокрашиванию  на LEC-маркер, LYVE-1.  Были найдены два-три LYVE-1-экспрессирующих сосуда, проходящие параллельно синусам (рис. 1 Й, К).

Лимфатический характер перисинусальных сосудов был оценен в дальнейшем  по наличию нескольких классических маркеров LEC.  Экспрессию основного фактора транскрипции LEC, Prox1, действительно удалось обнаружить в сосудах с LYVE-1+, используя  иммуноокрашивание диких мышей (Расширенные данные, рис. 2А) или трансгенных мышей, экспрессирующих tdTomato (ТДТ) (прим. – трансгенный флуоресцентный протеин) под Prox1 промоутер (Prox1tdT;. рис 2А). Аналогично периферическим лимфатическим сосудам, обнаружена  способность LYVE-1 сосудов к экспрессии подопланина ( прим – протеин, кодируемый PDPN геном, имеет отношение к выработке мембранных гликопротеинов, есть работы по его участию в опухолевой инвазии)  (рис. 2Б, расширенные данные рис. 2Б,) и рецептора 3 сосудистых факторов  роста эндотелия  (VEGFR3) (рис. 2В, расширенные данные Рис. 2Г). Инъекция  специфеческого-VEGFR3, рекомбинантного эндотелиального фактора сосудистого роста – с (VEGF-c) в цистерну магна  привело к увеличению диаметра менингеальных лимфатических сосудов, при исследовании на 7ой день после инъекции (рис. 2 Г,Д. Расширенные данные рис. 2 Д), что указывает на функциональное влияние VEGFR3 на менингеальные лимфатические эндотелиальные клетки (LEC)  . Наконец, присутствие LEC в мозговых оболочках было подтверждено с помощью проточной цитометрии; была обнаружена  CD45- CD31+ подопланин + популяция клеток (LEC) в твердой мозговой оболочке, которая сходна с уже найденной такой популяцией в  коже и диафрагме (Расширенные данные, рис. 3). Нам удалось обнаружить потенциально схожую структуру в человеческой твердой мозговой оболочке (LYVE -1+ подопланин+ CD68-); (Расширенные данные рис. 4), однако необходимы  дальнейшие исследования с целью оценить и охарактеризовать в полной мере  локализацию и организацию мозговых лимфатических сосудов в центральной нервной системе человека.

Существует два типа афферентных лимфатических сосудов  —  начальные и собирательные. Они отличаются анатомически (то есть по наличию или отсутствию окружающих  гладкомышечных клеток и лимфатических клапанов),  по их паттерну экспрессии адгезии молекул,  их доступности для входа жидкостных сред и клеточных элементов. В  отличие от синусов, менингеальные лимфатические сосуды лишены гладкомышечных клеток (Рис. 2 Е,Ж). Кроме того, менингеальные лимфатические сосуды оказались также положительным на хемоаттрактантный  белок иммунных клеток  CCL21 (ссылки 11, 12; Расширенные данные рис 5А.). В отличие от кровеносных сосудов, которые демонстрируют непрерывный паттерн клаудин-5 (прим. из семейства клаудинов – внутренних мембранных протеинов) и сосудистого эндотелиального(VE) кадгерина (прим. семейство кадгеринов – трансмембранные протеины), менингеальные лимфатические сосуды обладают точечным паттерном экспрессии этих молекул аналогично лимфатическим сосудам диафрагмы (Расширенные данные, рис. 5Б-Е). Кроме того, экспрессия интегрина-  α9, которая характерна для лимфатических сосудов, не была найдена в менингеальных лимфатических сосудах, но легко обнаружена в кожной лимфатической сети (Расширенные данные, рис. 5 Г,Д). В совокупности, эти результаты показывают, что менингеальные лимфатические сосуды обладают анатомическими и молекулярными чертами, характерными для инициальных лимфатических сосудов.  Кроме того,  при электронной микроскопии  оболочек выявлены типичные ультраструктурные характеристики лимфатических сосудов, которые представляют собой несплошную базальную мембрану в окружении якорных  нитей (Рис 2 (З), Расширенные данные, Рис 5 И).

Рис. 1. Аблюминальное распространение менингеальных Т-клеток и идентификация Lyve-1 – экспрессирующих сосудов, расположенный рядом с синусами твердой мозговой оболочки.

Изображение: журнал Nature.

Рис. 1. Аблюминальное распространение менингеальных Т-клеток и идентификация Lyve-1 – экспрессирующих сосудов, расположенный рядом с синусами твердой мозговой оболочки.
А) Схематическое изображение препарата твердой мозговой оболочки. ВСС – верхний сагиттальный синус, ПС – поперечный синус. Б) Отображение CD3e — маркировки в тотальном препарате мозговых оболочек (масштабная линейка – 2000 мкм). Вкладки – увеличенные изображения выделенных участков (масштабная линейка 90 мкм и 150 мкм для верхнего и нижнего изображений соответственно). Краситель – DAPI (4′, 6-диамидин-2-фенилиндол) В) Схематическое изображение коронарного среза тотального препарата мозговых оболочек Г) Полученное изображение коронарного среза тотального препарата мозговых оболочек (масштабная линейка – 200 мкм) Д) Отображение CD3e и CD31-иммуномаркировки в коронарном срезе тотального препарата мозговых оболочек. Масштабная линейка – 100 мкм. Вкладка – увеличенное изображение выделенного участка (масштабная линейка – 30 мкм) Е) Количественное соотношение синусальных Т-клеток, расположенных люминально и аблюминально к верхнему сагиттальному синусу (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), было проанализировано 18 участков от 3 животных; ***P = 0.0008, критерий Манна – Уитни) Ж) Слева – изображение CD3e и MHCII-экспрессирующих клеток вокруг верхнего сагиттального синуса (рисунки мозговых оболочек возле данного изображения и в дальнейшем обозначают локализацию изображаемых участков; масштабная линейка 50 мкм). Среднее изображение – увеличение участка, выделенного на картинке слева (масштабная линейка 10 мкм). Справа – увеличенное изображение CD3- и MHCII-экспрессирующих клеток (масштабная линейка 10 мкм) З) Изображение CD31 и CD3e-маркировки вокруг верхнего сагиттального синуса ( масштабная линейка 30 мкм) И) Количественное соотношение Т-клеток на каждый мм сосудов в перисинусальных CD31+ сосудах и в кровеносных менингеальных сосудах аналогичного диаметра (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), материалы от 3х животных; P = 0.05, односторонний тест Манна – Уитни) Й) Изображение Lyve-1-маркировки на тотальном препарате мозговых оболочек (масштабная линейка 1000 мкм) К) Увеличенное изображение Lyve-1 – экспрессирующих сосудов (масштабная линейка 70 мкм); стрелками обозначены Lyve-1+ макрофаги. Л) Изображение CD31 и Lyve-1-маркировки коронарного среза верхнего сагиттального синуса (масштабная линейка 70 мкм) М) Увеличенное изображение Lyve-1-положительного сосуда (масштабная линейка 50 мкм). Вкладка – увеличение этого же сосуда в 1,7 раза, стрелкой указан просвет сосуда.

Обладая многими из тех же атрибутов, что и  периферические лимфатические сосуды, общая организация и распределение менингеальной лимфатической сосудистой сети имеет определенные уникальные особенности.  Менингеальная лимфатическая сеть, похоже,  берет своё начало от обоих глаз и проходит выше обонятельной луковицы, прежде чем выравнивается около  синусов (Дополнительное Видео 2). По сравнению с диафрагмой, менингеальная лимфатическая сеть покрывает меньшее  количество ткани и образует менее сложную сеть, состоящую из узких сосудов (Расширенные данные, рис 5Й;. Дополнительное Видео 2). Сосуды больше и сложнее у поперечных синусов, чем у верхнего сагиттального синуса (Расширенные данные, рис 5Й). Различия в сосудистых сетях может быть обусловлено окружающей средой, в которой обитают сосуды — более высокое давление цереброспинальной жидкости в центральной нервной системе по сравнению с  давлением межклеточной жидкости в периферических тканях может повлиять на разветвление сосудов, а также ограничить рост.

Далее была изучена функциональная способность  менингеальных лимфатических сосудов  осуществлять отток жидкости и клеток от  мозговых оболочек/ спинномозговой жидкости. Взрослым мышам под анестезией одновременно вводили флуоресцин внутривенно и флуоресцентные трассирующие красители (QDot655) интрацеребровентрикулярно, а затем  через истонченный череп была произведена многофотонная микроскопия. Выровненные сосуды, наполненные QDot655, но не с флуоресцином, были замечены  вдоль верхнего сагиттального синуса ( Рис 3А-Г; Дополнительное  Видео 3), предполагая, что не сосуды  сердечно-сосудистой системы осуществляли отток спинномозговой жидкости. Этот дренаж  спинномозговой жидкости в менингеальные сосуды может быть  дополнением  к ранее описанной фильтрации спинномозговая жидкости через паутинные грануляции (Расширенные данные, рис. 6А). Инъекцией Alexa488 с конъюгированными анти-LYVE-1 антителами интрацеребровентрикулярно пометили менингеальные лимфатические сосуды (. Расширенные данные, рис 6 Б,В; Дополнительное Видео 4). Кроме того, ко-инъекция  QDot655 и Alexa488 с конъюгированными  анти-LYVE-1 антителами интрацеребровентрикулярно показала, что менингеальные лимфатические сосуды были действительно наполнены QDot655, и, таким образом, осуществляли отток спинномозговой жидкости (рис. 3 Д). Визуализация заполненных QDot655 лимфатических сосудов показала более медленный поток, но схожий в направлении поток  в менингеальных лимфатических сосудах по сравнению с соседними кровеносными сосудами (Дополнительное Видео 5), подобно тому, что наблюдалось за пределами центральной нервной системы.

Рис. 2 Молекулярная и структурная характеристика менингеальных лимфатических сосудов. Изображение: журнал Nature.

Изображение: журнал Nature.

Рис. 2 Молекулярная и структурная характеристика менингеальных лимфатических сосудов
А) Изображение экспрессии Prox1 в Lyve-1-положительных сосудах в синусах твердой оболочки мышей с Prox1tdT (масштабная линейка 10 мкм) Б) Изображения маркировки подопланином и Lyve-1 в синусах твердой оболочки (масштабная линейка 40 мкм) В) Изображение окрашивания синусов твердой оболочки VEGFR3 и Lyve-1 (масштабная линейка 20 мкм) Г, Д) Взрослым мышам интрацеребровентрикулярно (в большую цистерну) ввели 4 мкг rhVEGF-c (Cys156Ser) или натрий-фосфатного буфера (PBS). Мозговые оболочки использовались через 7 или 14 дней после инъекции. Г) Изображение маркировки Lyve-1 и Prox1 на 7й день после инъекции (масштабная линейка 30 мкм) Д) Количественное соотношение диаметра менингеальных лимфатических сосудов (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), материалы от 4х животных с каждой группы; P = 0.05, двусторонний дисперсионный анализ с критерием Бонферрона) Е, Ж) Изображения гладких мышечных клеток (альфа-гладкомышечного актина, a-SMA) и Lyve-1 маркировки в синусах твердой оболочки (масштабные линейки50 мкм и 20 мкм) З) Микрофотография менингеальных лимфатических сосудов, , полученная на малом увеличении (трансмиссионная электронная микроскопия). Масштабная линейка 5 мкм. Вкладка – увеличенное изображение выделенного участка. Желтыми стрелками обозначена базальная мембрана, красными – фиксирующие филаменты, зелеными- клеточные соединения.

Классические лимфатические сосуды, в дополнение к дренированию  интерстициальной жидкости, позволяют клеткам путешествовать из тканей к лимфатическим узлам.  Поэтому мы исследовали, способны ли менингеальные лимфатические сосуды переносить лейкоциты. Иммуногистохимический анализ  оболочек показал, что 24% всех Т-клеток и 12% всех клеток MHCII (клетки, несущие комплекс гистосовместимости II)  были найдены в просвете этих сосудов (Рис. 3Е, Расширенные данные, рис 7А,Б). Кроме того, CD11c+ клетки и B220+ клетки были также найдены в менингеальных лимфатических сосудах юных мышей (Расширенные данные, рис. 7В-Е).

Доказано, что клеточные и растворимые компоненты спинномозговой жидкости способны вызывать иммунный ответ в шейных лимфоузлах. Предполагаемый путь их движения – через решетчатую пластинку в лимфатические сосуды слизистой оболочки носа. Для того, чтобы определить, сообщаются ли напрямую менингеальные лимфатические узлы с глубокими шейными лимфоузлами, мы ввели мышам синий краситель Эванса интрацеребровентрикулярно, и обследовали периферические лимфатические узлы на предмет его наличия спустя 2 часа. Через 30 минут после введения, краситель был выявлен, как мы и ожидали, в менингеальных лимфатических сосудах и синусе (Расширенные данные, рис. 8 А-В), а также в глубоких шейных лимфоузлах — рис. 3 Ж,З (при том, что в поверхностных шейных лимфоузлах синий Эванса отсутствовал). Позже краситель был обнаружен и в поверхностных шейных лимфоузлах. В то же время, никаких следов синего красителя Эванса не было обнаружено в окружающей нелимфатической ткани. Интересно также то, что при введении красителя в слизистую оболочку носа, в глубоких шейных лимфоузлах он найден не был (Расширенные данные, рис.8 Г,Д), что приводит к пониманию того, что именно менингеальные лимфатические сосуды, а не лимфатические сосуды слизистой оболочки носа, являются первичным путем дренажа спинномозговой жидкости в глубокие шейные лимфоузлы.

Резекция глубоких шейных лимфоузлов, находящихся под влиянием Т-клеточных компартментов мозговых оболочек, привела к повышению количества менингеальных Т-клеток (Расширенные данные, рис. 9 А-Д). Причиной этому, предположительно, может быть невозможность дренажа Т-клеток из менингеальных пространств, что соответствует положению о прямой связи между мозговыми оболочками и глубокими шейными лимфоузлами. Для того, чтобы более наглядно продемонстрировать эту связь, мы лигировали лимфатические сосуды, которые дренируют глубокие шейные лимфоузлы (Расширенные данные, рис. 9 Е), и ввели мышам синий краситель Эванса интрацеребровентрикулярно. Никаких скоплений красителя в глубоких шейных лимфоузлах у лигированных мышей обнаружено не было, в то время как в группе контроля результат был противоположным (Расширенные данные рис. 9 Ж). Более того, наблюдалось увеличение диаметра менингеальных лимфатических сосудов (рис.3 З,И; Расширенные данные рис.9 З), сходное с лимфатическими отеками, наблюдаемыми в периферических тканях. Эти результаты подтверждают предположение о физической связи между менингеальными лимфатическими сосудами и глубокими шейными лимфоузлами.

Пути дренажа спинномозговой жидкости в периферию интересовали ученых в течение десятилетий. Результатом стало описание нескольких путей выхода спинномозговой жидкости из ЦНС.  Недавно обнаруженные менингеальные лимфатические сосуды являются новым путем дренажа спинномозговой жидкости, и представляют собой более традиционный путь выхода иммунных клеток за пределы ЦНС. Таким образом, пути, описанные нами, могут быть вторым шагом в системе дренажа жидкости из мозговой паренхимы на периферию – после того, как она дренировалась в спинномозговую жидкость с помощью недавно обнаруженной глимфатической системы (Расширенные данные,  рис. 10).

Наличие в ЦНС функционирующей классической лимфатической системы означает необходимость переосмысления всех существующих догм об устойчивости и иммунных привилегиях головного мозга. В свою очередь, дисфункция менингеальных лимфатических сосудов может быть основной причиной многочисленных неврологических заболеваний, где «основным игроком» является измененная иммунная система – рассеянного склероза, болезни Альцгеймера и некоторых форм лимфедемы.

Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Рис. 3. Функциональная характеристика менингеальных лимфатических сосудов
А-Г) Срезы верхнего сагиттального синуса мышей, которым интравенозно был введен флуоресцеин, а интрацеребровентрикулярно — QDot655 (3 мыши) А,Б) Изображения, полученные при малом увеличении: визуализация маркировки флуоресцеином менингеальных кровеносных сосудов и верхнего сагиттального синуса (масштабная линейка 20 мкм). QDot655, напротив, более заметен в перисинусальных сосудах — В,Г) – масштабная линейка 20 мкм Д) Срез наполненного спинномозговой жидкостью сосуда, взятого у мыши, которой интрацеребровентрикулярно были введены QDot655 и Alexa488 с конъюгированными анти-LYVE-1 антителами (3 мыши, масштабная линейка 30 мкм) Е) Верхнее изображение – иммуномаркировка CD3e, MHCII и Lyve-1 в мозговых оболочках (масштабная линейка 15 мкм) Нижнее изображение – 3D-реконструкция менингеального лимфатического сосуда с люминальной локализацией CD3e и MHCII-экспрессирующих клеток (масштабная линейка 20 мкм) Ж, З) Взрослым мышами интрацеребровентрикулярно ввели 5 мл 10% синего красителя Эванса. Поверхностные шейные лимфатические узлы (Ж) и глубокие шейные лимфатические узлы (З) были проанализированы 30 минут спустя после введение (5 мышей). Белые стрелки обозначают лимфатические узлы, желтые – наполненные красителем сосуды возле внутренней яремной вены в глубоких шейных лимфоузлах (З). И, Й) Собирательные сосуды, дренирующие глубокие шейные лимфоузлы (обозначены желтыми стрелками в «З») были лигированы или ложно-прооперированы. 8 часов спустя после лигирования, в мозговые оболочки был введен Lyve-1. И) — изображения маркировки Lyve-1 поперечного синуса у лигированных и ложно – прооперированных мышей (масштабная линейка – 30 мкм). Й) – точечная диаграмма, что отображает показатели диаметра менингеальных лимфатических сосудов (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), материалы от 5 х животных в каждой группе; P = 0.031, критерий Манна – Уитни)

Методы

Статистические методы для предопределения объема выборки не использовались.

Животные

Особи мужского и женского пола C57Bl/6, NOD.Cd11c-YFP и Prox1tdT были приобретены в Jackson Laboratories, и содержались в комнатах с контролируемыми температурой и влажностью, а также со световым режимом 1212 ч (свет включался в 7 утра). Вся порода содержалась в идентичных условиях. Все процедуры, проводимые с животными, осуществлялись в соответствии с нормами по уходу и использованию животных соответствующего комитета Виргинского университета. В этом исследовании участвовали только взрослые особи (возрастом 8-10 недель). Размер выборки был установлен в соответствии с похожими, ранее опубликованными экспериментами. В каждую экспериментальную группу выбирались животные из разных клеток для обеспечения метода слепого отбора.

Человеческие образцы

Образцы твердой мозговой оболочки вместе с верхним сагиттальным синусом были получены с кафедры Патологии и Нейрохирургии Виргинского университета. Все образцы получены после вскрытия пациентов, которые дали свое согласия на использование их тела для исследовательских и научных целей без каких-либо ограничений. Образцы были зафиксированы 10% раствором формалина, и в дальнейшем хранились в этих же условиях.

   Иммуногистохимическое исследование оболочек мозга

Эвтаназия мышей была проведена путем интраперитонеального введения эутазола и перфузирования 0,1 М фосфатным буфером (PBS) в течение 5 минут. Кожа головы была удалена, а мышцы отделены от костей. После удаления нижней челюсти и частей черепа выше верхней челюсти, с помощью хирургических ножниц был удален свод черепа. Мозговые оболочки, все еще связанные с черепом, были зафиксированы PBS с 2% параформальдегидом (PFA) в течение 24 ч при температуре 4о или раствором этанола и ацетона в соотношении 1:1 при температуре 20о в течение 20 мин (в зависимости от антител). Далее были отделены твердая и паутинная мозговые оболочки. Для анализа мягкой мозговой оболочки мозг, изъятый из черепной коробки, замораживался, после чего криостатом изготовлялись поперечные срезы толщиной 40 мкм. Сосудистое сплетение отделяли от желудочков незафиксированного мозга, и в дальнейшем фиксировали 2% параформальдегидом в фосфатном буфере в течение 24 часов. Для приготовления корональных срезов мозговых оболочек, в синусы перед разделением вводили 100 мл матригеля.  Твердую и паутинную оболочки отделяли от свода черепа, замораживали, и с помощью криостата изготовляли срезы толщиной 10 мкм, которые далее помещались в желатинизированную среду.

Тотальные препараты оболочек, точно так же, как и срезы, выдерживались в фосфатном буфере с 2% содержанием нормальной сыворотки (козьей или куриной), 1% BSA (бычий сывороточный альбумин), 0,1 % Triton-X-100 и 0,05% Tween 20 (полисорбат твин 20) в течение 1 ч при комнатной температуре с дальнейшим выдерживанием всю ночь  при температуре 4оС в фосфатном буфере с 1% BSA и 0,5 % Triton-X-100  и соответствующими первичными антителами  : анти-CD31 (eBioscience, clone 390, 1:100); анти—CD3e (eBioscience, clone 17A2, 1:500), анти—MHC II (eBioscience, clone M5/114.15.2, 1:500), анти-Lyve-1 (eBioscience, clone ALY7, 1:200), анти-Prox1 (Angiobio, 11- 002,1:500),анти-подопланин (eBioscience,clone8.1.1,1:100), анти — VEGFR3 (R&D Systems,AF743,1:100), анти -a-SMA (Sigma-Aldrich,clone1A4,1:500),анти-VE-кадгерин (eBioscience, clone BV13 1:100), анти-клаудин-5 (Molecular Probes, 352588, 1:200), анти-CCL21 (R&D Systems, AF457, 1:100), анти-интегрин-a9 (R&D Systems, AF3827, 1:100), анти-B220 (eBioscience, clone RA3-6B2, 1:100), анти-CD11c (eBioscience, clone N418, 1:100) . Затем тотальные препараты и срезы были трижды промыты (каждый раз по 5 минут) в фосфатном буфере c дальнейшим выдерживанием в Alexa- fluor 488/594/647 с куринымикозьими антикроличьимиантикозьими IgG антителами или PE/Cy3-конъюгированным стрептавидином в течение 1 часа при комнатной температуре в фосфатном буфере с 1% BSA и 0,5 % Triton-X-100  . После 5-минутного окрашивания DAPI (4,6-диамин-2-фенилиндол, флуоресцентный краситель), образцы были снова промыты буфером и зафиксированы под покровным стеклом для дальнейшего исследования. Для пре-адсорбционных экспериментов, анти- VEGFR3 и анти-подопланиновые антитела были выдержаны в фосфатном буфере с 1% BSA и 0,5 % Triton-X-100  с рекомбинантными мышиными VEGFR3 и подопланином в соотношении 1:10 при температуре 4оС в течение ночи перед окрашиванием.

Для человеческих образцов, из зафиксированного формалином верхнего сагиттального синуса были изготовлены срезы толщиной 2 мм, которые в течение ночи выдерживались в фосфатном буфере с 4% параформальдегида. Затем ткани заливались реактивом ОСТ, после чего криостатом изготавливались срезы толщиной 10 мкм, которые далее помещались в желатинизированную среду. Антигенный материал получали путем инкубации срезов в натрий цитратном буфере с рН 6,0 при температуре

80 о С в течение 20 минут. После промывания фосфатным буфером, эндогенные биотины блокировались 30-минутной выдержкой в том же PBS с 3% H2O2 , затем в PBS с 2% содержанием нормальной сыворотки (козьей или куриной), 1% BSA, 0,1 % Triton-X-100 и 0,05% Tween 20 в течение часа при комнатной температуре. Следующий шаг – выдерживание всю ночь при температуре 4оС в буфере с 1% BSA и 0,5 % Triton-X-100 и растворенными анти-Lyve-1 (ab36993, Abcam, 1:200), анти-подопланином (HPA007534, Sigma-Aldrich, 1:200) или анти-CD68 (HPA048982, Sigma-Aldrich, 1:1,000). Затем срезы промывались 3 раза ( по 5 минут каждый) в PBS с дальнейшей выдержкой в биотин-конъюгированных козьих антикроличьих антителах в течение 1ч при комнатной температуре. После чего срезы были выдержаны в пероксидазном субстрате DAB (диаминобензидин) в течение нескольких минут, доокрашены гематоксилином, обезвожены и зафиксированы под покровным стеклом для дальнейшего исследования. Были окрашены и проанализированы 9 образцов тканей человека, в двух из них были обнаружены лимфатические структуры.

Анализ изображений

Изображения были получены с использованием конфокальной системы Leica TCS SP8 (Leica Microsystems) и программного обеспечения LAS AFS. Для получения изображений тотального препарата оболочек использовался объектив с десятикратным увеличением и апертурным числом 0,25. Остальные конфокальные изображения были получены с использованием объектива с увеличением х20 и апертурным числом 0,7, а  также иммерсионного объектива х40 с апертурным числом 1,3. Разрешение всех изображений – 512х512 пикселей.

Количественная оценка была произведена с использованием программного обеспечения FIJI (NIH). Процентное отношение люминальных Т-клеток определялось путем подсчета количества таких клеток с люминальной локализацией в синусе. Густота определялась путем деления количества Т-лимфоцитов на площадь мозговых оболочек. Густота Prox1-положительных клеток определялась путем деления количества Prox1+ ядер на площадь лимфатических сосудов. Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism. Различные тесты, применяемые в ходе исследований, поданы в тексте описания каждого эксперимента. Резко отклоняющиеся по значению образцы были устранены путем использования критерия Граббса с уровнем значимости 0,01 (применялось только для rh-VEGF-c –эксперимента). Оценка вариативности между группами не проводилась.

Электронная микроскопия

Мозговые оболочки были отобраны за схемой, описанной выше, и зафиксированы  в 2,5% глутаральдегиде, 2% параформальдегиде в 0,1 М какодиловокислом натриевом буфере с рН 7,4. Затем – снова зафиксированы в 2 % тетрахлориде осмия в 0,1 М какодиловокислом натриевом буфере с 0,15 % ферроцианида калия. После ополаскивания в буфере, ткань была обезвожена путем пропускания через растворы этанола разных концентраций, а затем – через раствор оксида пропилена. Следующий шаг – инфильтрация, заливка эпоксидной смолой и полимеризация в течение ночи при температуре 70оС. Срезы толщиной 0,5 мкм были окрашены толуидиновым синим для исследования световой микроскопией. Ультратонкие срезы – 80 нм – были изготовлены с использованием Tecnai TF20 TEM с камерой AMT XR41 (Расширенные данные, Рис. 5И)  или Tecnai F20 TEM с камерой UltraScanCCD.

Многофотонная микроскопия

Мыши были анестезированы интраперитонеальной инъекцией кетаминаксилазина , после чего интрацеребровентрикулярно было введено 5 мл QDot655 или 5 мл Alexa488-конъюгированных анти-Lyve-1 антител. Также интравенозно было введено 25 мл 10 % флуоресцеина натриевой соли или 5 мл QDot655. Менингеальные лимфатические сосуды отображались через истонченный череп. Внутренняя температура животных во время процедуры — 37оС, и поддерживалась на этом уровне. Нами использовалась мультифотонный микроскоп Leica TCS SP8, снабженный перестраиваемым лазером ChameleonUltraII Ti:Sapphire. GFP и QDot655 были активированы возбуждающей волной, длиной 880 нм. Изображения были получены с использованием водноиммерсионного объектива х25 с числовой апертурой 0,95. Четырехмерные изображения были созданы путем получения изображения из плоскостей z,x,y в динамике. Финальные изображения были проанализированы с помощью Imaris.

Маркировка васкулярных компартментов

Для того, чтобы изучить аблюминальную локализацию синусальных Т-клеток, мышам интравенозно ввели 10 мг FITC-конъюгированных анти-CD45 антител или контрольных изотипов за 1 ч до эвтаназии. Чтобы установить, что менингеальные лимфатические сосуды не являются частью сердечно-сосудистой системы, мышам было введено 100 мл DyLight 488 Lycopersicon Esculentum Lectin за 5 минут до эвтаназии.

Активация VEGFR3 in vivo

Мышам интрацеребровентрикулярно было введено 4 мг rh-VEGF-c (Cys156Ser, R&D Systems) или PBS.  Мозговые оболочки были отобраны через 7 или через 14 дней после инъекции.

Введение синего красителя Эванса и его определение

Мыши были анестезированы интрапариетальным введением кетаминаксилазина, после чего было введено 5 мл 10% синего красителя Эванса – интрацеребровентрикулярно в цистерну магна или интраназально. 30 минут спустя была проведена эвтаназия с использованием CO2 , и лимфатические узлы, дренирующие ЦНС, были удалены и обследованы на наличие красителя. Твердая мозговая оболочка была также извлечена и методом конфокальной микроскопии проанализирована на предмет наличия и локализации синего красителя Эванса. Интенсивность окрашивания измерялась с помощью прибора FIJI.

Анализ мозговых оболочек методом проточной цитометрии

Мыши были перфузированы 0,1М PBS в течение 5 минут, после чего была проведена декапитация, а черепа быстро вскрыты. Нижние челюсти и костный материал выше верхней челюсти были удалены. Хирургическими ножницами был удален свод черепа. Оболочки были аккуратно отделены от внутренней поверхности черепа и поверхностей мозга с помощью щипцов Dumont#5. Затем путем использования нейлоновой сетки со стерильными пластиковыми фиксаторами, была получена суспензия отдельных клеток. Для получения изолированных лимфатических эндотелиальных клеток, мозговые оболочки (а также диафрагма и кожа уха) в течение часа вываривались в 60 U мл -1 ДНК-азы или 0.41 U мл -1  Liberase TM. Затем клетки были центрифугированы в течение 10 минут, надосадочная жидкость изъята, а сами клетки перерастворены в холодном буфере FACS (анализ сортировки флюоресцентно-активированных клеток) — (pH7,4; 0.1M PBS; 1mMEDTA; 1%BSA). Клетки были окрашены внеклеточным маркером с антителами к CD45-PacificBlue, (BD Bioscience), CD45-фикоэритрин (PE)-Cy7 или eFluor 450 (eBioscience), TCRb-Alexa780 (eBioscience), CD4-Alexa488 (eBioscience), CD8-перидинин-хлорофилл (PerCP)-Cy5.5 (eBioscience), CD44-аллофитоцианин (APC) (eBioscience), CD62L-PE (eBioscience), CD71-APC (eBioscience), подопланин- PE (eBioscience), CD31-Alexa647 (eBioscience), B220-PE (eBioscience), CD19- BB515 (BD Bioscience). За исключением лимфатических эндотелиальных клеток, весь остальной клеточный материал был зафиксирован 1%PFA в 0.1M pH 7.4 PBS. База данных была собрана с использованием проточного цитометра CyAn ADP High-Performance Flow Cytometer (Dako) или Gallios (Beckman Coulter), с дальнейшей обработкой с помощью  FlowJo. Для наиболее точного подсчета клеток использовались прямое и боковое светорассеяние. Также устанавливалось, живы ли исследуемые клетки (с помощью LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit). Затем клетки исследовались на наличие необходимых для каждого клеточного типа маркеров. Эксперимент проводился на мозговых оболочках 3х мышей с каждой группы. Обработка данных с помощью Excel и GraphPadPrism.

Резекция глубоких шейных лимфоузлов, лигирование и проведение «ложных операций»

8-недельные мыши были анестезированы кетаминомксилазином, шерсть в области шеи была удалена, а область обеззаражена йодом и 70% этанолом. В глаза животным капнули специальный раствор для предупреждения высыхания. Разрез был произведен по срединной линий на 5 мм выше ключицы. Грудино-ключично-сосцевидная мышца была оттянута, и глубокие шейные лимфоузлы были удалены с помощью щипцов. Для эксперимента с лигированием, собирательные лимфатические сосуды спереди от глубоких шейных лимфоузлов были лигированы с помощью нейлоновых нитей (9-0Ethilonblack6’’VAS100-4).Ложно-оперированным мышам был также сделан надрез с отведением мышцы, но дальнейшие операции не проводились (сосуды не были лигированы, лимфоузлы не удалялись). Затем мыши были зашиты, и восстанавливались в необходимых условиях. Прооперированным мышам давали растворенные в питьевой воде болеутоляющие средства: 50 mг l-1 в первые 3 дня, по 0,16 мг в последующие 2 недели.

Расширенные данные

Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Расширенные данные, Рис. 1. Менингеальный иммунитет и лимфатические сосуды в синусах твердой мозговой оболочки
А) Изображение окрашивания CD31 тотального препарата мозговых оболочек (масштабная линейка 2000 мкм) Б) Изображение Т-клеток (окрашены CD3e, обозначены стрелками) в твердой паутинной и мягкой мозговых оболочках, а также в синусах твердой мозговой оболочки и в сосудистом сплетении (масштабная линейка 70 мкм) В) Количественное соотношение густоты Т-клеток в различных менингеальных компартментах (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), по 6 животных в каждой группе из 2х независимых экспериментов, Р= 0, 001; критерий Крускала-Уоллиса, тест Данна) Г) Количественное соотношение MHCII-экспрессирующих клеток в различных менингеальных компартментах (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), по 6 животных в каждой группе из 2х независимых экспериментов, Р= 0, 001; критерий Крускала-Уоллиса, тест Данна) Д) Взрослым мышам интравенозно ввели 100 мл DyLight 488 с лектином за 5 мин перед эвтаназией для обеспечения маркировки сердечно-сосудистой системы. Мозговые оболочки были отобраны и окрашены анти- CD3e. На изображении- локализация Т-клеток внутри (белые стрелки) и снаружи синуса – желтые стрелки (2 мыши, масштабная линейка 70 мкм) Е) Взрослым мышам ввели 10 мкг FITC-конъюгированных анти- CD45 антител или FITC-конъюгированных изотипных антител. Мозговые оболочки были отобраны через час после инъекции и окрашены анти- CD3e. На изображении показано иммуномаркировка CD3e вокруг синусов твердой мозговой оболочки. CD45-положительные клетки не располагаются рядом с CD3e1-клетками, что предполагает аблюминальную локализацию последних (2 мыши в каждой группе, масштабная линейка- 20 мкм) Ж) 3D-реконструкция локализации лимфатических сосудов вокруг верхнего сагиттального синуса. Взрослым мышам интравенозно ввели 100 мл DyLight 488с лектином за 5 минут до эвтаназии для окрашивания сердечно-сосудистой системы. Мозговые оболочки были отобраны и маркированы анти-Lyve-1. Отсутствие окрашивания лектином в Lyve-1-положительных менингеальных лимфатических сосудах предполагает отсутствие связи между этими сосудами и сердечно-сосудистой системой (3 мыши, масштабные линейки: слева – 50 мкм, справа – 120 мкм)
Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Расширенные данные, Рис. 2. Идентификация, характеристика и оценка экспрессии маркеров классических лимфатических эндотелиальных клеток менингеальными лимфатическими сосудами
А) Изображение маркировки Prox1 в менингеальных Lyve-1-экспрессирующих сосудах (3 мыши, масштабная линейка 10 мкм) Б) Схематическое изображение тотального рассечения диафрагмы В) Характеристика специфичности антител подопланина. Изображение диафрагмы, окрашенной анти- Lyve-1 и анти-подопланином (ві), контрольными изотипом (віі) или заранее инкубированным анти-подопланином, насыщенным рекомбинантным подопланиновым белком (вііi, масштабная линейка 20 мкм) Г) Характеристика специфичности антител VEGFR3. Изображение диафрагмы и твердой мозговой оболочки, окрашенных анти- Lyve-1 и анти- VEGFR3 (гi), вторичными антителами (гii) или заранее инкубированным анти- VEGFR3 насыщенным рекомбинантным белком VEGFR3 (гiii, масштабная линейка 20 мкм) Д) Количественное соотношение числа Prox1+ клеток на каждый квадратный миллиметр лимфатического сосуда (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), по 4 животных в каждой группе)
Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Расширенные данные, Рис. 3 Идентификация популяций менингеальных лимфатических клеток методом проточной цитометрии. Анализ сортированных флуоресцентно-активированных лимфатических клеток диафрагмы, кожи (уха) и синусов твердой мозговой оболочки.
А) Была применена стратегия синхронизации для идентификации лимфатических эндотелиальных клеток (CD31+, подопланин+). Лимфатические эндотелиальные клетки определяются как живые, CD45- и CD31+, подопланин+, клетки. Б) Точечные диаграммы для лимфатических эндотелиальных клеток диафрагмы,кожи и твердой мозговой оболочки взрослых мышей.
Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Расширенные данные, рис. 4. Идентификация лимфатических сосудов в твердой мозговой оболочке человека.
А) Изображение фиксированного в формалине коронального среза верхнего сагиттального синуса человека Б, В) Изображения коронального среза верхнего сагиттального синуса человека, окрашенного Lyve-1 (масштабная линейка 100 мкм). Выделенная в «В» область отображает наличие Lyve-1-экспрессирующих макрофагов в мозговых оболочках человека, точно так же, как это наблюдалось и у мышей. Г) Изображения коронального среза верхнего сагиттального синуса человека, окрашенного Lyve-1 и CD68. Обратите внимание на отсутствие положительного результата на CD68 в Lyve-1-положительных структурах (масштабная линейка 50 мкм) Д) Изображения коронального среза верхнего сагиттального синуса человека, окрашенного подопланином и Lyve-1 (масштабная линейка 50 мкм).
Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Расширенные данные, рис. 5. Первичные лимфатические свойства менингеальных лимфатических сосудов
А) Изображение менингеальных лимфатических сосудов, маркированных CCL21 и Lyve-1 (масштабная линейка 10 мкм) Б, В) Изображение менингеальных кровеносных сосудов, окрашенных на Lyve-1 и сосудистым эндотелиальным кадгерином (VE-Cadherin) – Б), и менингеальных лимфатических сосудов, окрашенных так же (В). Стрелки указывают на скопление кадгерина. Масштабная линейка- 10 мкм. Г-Е) Изображение менингеальных кровеносных (Г) и лимфатических сосудов (Д), а также лимфатических сосудов диафрагмы (Е) , окрашенных клаудином-5 и Lyve-1. Стрелками указаны скопления клаудина-5. Масштабная линейка – 10 мкм. Ж, З) Изображения кожи (уха) – Ж, и мозговых оболочек (З), маркированных интегрином- α9 и Lyve-1. Масштабные линейки – 40 мкм. В менингеальных лимфатических сосудах экспрессия интегрина не обнаружена. И) Микрофотографии менингеальных лимфатических сосудов, полученных на малом увеличении (трансмиссионная электронная микроскопия), масштабная линейка – 2 мкм. L- просвет, SC,поддерживающие клетки; LEC-лимфатическая эндотелиальная клетка; BEC-синусальные эндотелиальные клетки. Красная стрелка указывает на фиксирующие филаменты. Й)Таблица, обобщающая морфологические свойства лимфатической сети различных участков мозговых оболочек и диафрагмы. Диаметры поданы в мкм, ветвление – количество ветвей на каждый миллиметр сосуда (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), материалы от 4х животных с каждой группы; *P = 0.05, **Р=0,01, ***Р=0,001; двусторонний дисперсионный анализ с критерием Бонферрона). Сравнения проводились между диафрагмой и верхним сагиттальным синусом, а также между верхним сагиттальным и поперечным синусами.
Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Расширенные данные, рис. 6. Дренаж спинномозговой жидкости в менингеальные лимфатические сосуды
А) Срез, отображающий дренаж спинномозговой жидкости как в синус, так и в менингеальные лимфатические сосуды. Краситель — QDot655, был введен интрацеребровентрикулярно (масштабная линейка 20 мкм) Б) Изображения CD31 и Lyve-1 –иммуноокрашивания тотального препарата мозговых оболочек. Взрослым мышам интрацеребровентрикулярно ввели 2,5 мг Alexa488-коньюгированных анти- Lyve-1 антител. 30 минут спустя оболочки были отобраны и окрашены anti-CD31. Lyve-1-антитела при инъекции in vivo освещают лимфатические сосуды (масштабная линейка 20 мкм) В) Срез верхнего сагиттального синуса взрослой мыши, которой интравенозно был введен QDot655, а интрацеребровентрикулярно — Alexa488-коньюгированные анти- Lyve-1 антитела. Ві — Корональный срез образца, представленного в «В». Сигнал от оставшихся частей черепа или обогащенных коллагеном структур над мозговыми оболочками выделен синим цветом. Віі — 3D- реконструкция срезов, представленных в «В» с локализацией менингеальных лимфатических сосудов под черепом (масштабная линейка 50 мкм)
Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Расширенные данные, рис. 7. Транспорт иммунных клеток менингеальными лимфатическими сосудами
А) Изображение Т-клеток (CD3e) и лимфатических эндотелиальных клеток (Lyve-1) в синусах твердой мозговой оболочки (масштабная линейка 20 мкм). Аii–Аiii — более детальная локализация Т-клеток. Б) Количественное соотношение синусальных Т-клеток и MHCII-экспрессирующих клеток в лимфатических сосудах (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), 7-8 мышей в группе) В, Г) Изображения окрашивания твердых мозговых оболочек мышей CD11cYFP с помощью Lyve-1 (масштабная линейка 20 мкм). Внутри менингеальных лимфатических сосудов — CD11c-положительные клетки (наиболее имоверно, дендритные) Д) Изображение B220+ клеток и лимфатических эндотелиальных клеток (Lyve-1), иммуномаркированных в оболочках головного мозга (желтые стрелки обозначают B220 +, CD11c– клетки ; масштабная линейка 20 мкм) Е) Точечные диаграммы, что отображают количество B220 + в синусах твердой мозговой оболочки, экспрессирующих CD19. Около 40% всех B220 +-клеток экспрессируют CD19.
Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Расширенные данные, рис. 8. Дренаж синего красителя Эванса в глубокие шейные лимфоузлы из менингеальных лимфатических сосудов, а не из слизистой носовой полости.
А-В) Взрослым мышам интрацеребровентрикулярно ввели 5 мл 10% синего красителя Эванса. Мозговые оболочки были отобраны спустя 30 минут после инъекции. Локализация красителя определялась конфокальной микроскопией. А) – Локализация красителя в синусе и менингеальных лимфатических сосудах. ( 9 мышей, масштабная линейка 40 мкм). Б) – Отображение флуоресцентной интенсивности красителя Эванса и Lyve-1 на поперечном срезе участка, представленного в «А». В) – Процентное соотношение средней интенсивности красителя Эванса в синусе, лимфатических сосудах и мозговых оболочках взрослой мыши (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), проанализировано 16 участков от 4 животных, Р= 0, 01; критерий Крускала-Уоллиса, тест Данна) Г, Д) Взрослым мышам интраназально ввели 5 мл 10% синего красителя Эванса. Показано успешное введение в слизистую носовой полости (Г) и отсутствие скопления красителя в глубоких шейных лимфоузлах (Д) спустя 30 минут после инъекции.
Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Расширенные данные, рис. 9. Влияние резекции глубоких шейных лимфоузлов и лигирования лимфатических сосудов на менингеальные иммунные компартменты.
А-Д) Глубокие шейные лимфатические узлы были удалены или лигированы. Спустя 3 недели после резекции, мозговые оболочки были отобраны, одиночные клетки изолированы и протестированы на содержание Т-клеток методом проточной цитометрии. Б) – Точечная диаграмма , отображающая наличие CD8+ и CD4+ Т-клеток в мозговых оболочках ложно-оперированных мышей или мышей с удаленными глубокими шейными лимфоузлами. В) Общее количество Т-клеток (TCRb+), CD4+ и CD8+ в мозговых оболочках ложно-оперированных мышей или мышей с удаленными глубокими шейными лимфоузлами (средние значения ± s.e.m.(стандартная ошибка среднего), 3 животных в каждой группе, *P = 0.018; **P = 0.006 (CD8), P = 0.003 (TCRb);критерий Стьюдента). Г) Экспрессия CD62L и CD44 Т-клетками CD4+. Д) Гистограмма, отображающая экспрессию CD71 менингеальными CD4+ Т-клетками в мозговых оболочках ложно-оперированных мышей или мышей с удаленными глубокими шейными лимфоузлами (по 3 животных в каждой группе). Е) Изображения операции лигирования. Для того, чтобы выделить лимфатические сосуды, перед операцией интрацеребровентрикулярно был введен синий краситель Эванса. Черные стрелки обозначают лимфатический узел, желтые – лигированные сосуды,наполненные красителем. Ж) Ложно-оперированным или лигированным животным интрацеребровентрикулярно ввели 5 мл 10% синего красителя Эванса. Глубокие шейные лимфоузлы были отобраны через 30 минут после инъекции и проанализированы на предмет содержания красителя. Представлены изображения, иллюстрирующие скопление красителя в глубоких шейных лимфоузлах ложно-оперированных мышей или мышей с лигированными сосудами. З) Количественное соотношение диаметра менингеальных лимфатических сосудов верхнего сагиттального и поперечного синусов у ложно-оперированных животных и у животных с лигированными собирательными лимфатическими сосудами.
Изображение: журнал Nature

Изображение: журнал Nature

Расширенные данные, рис. 10. Связь между глимфатической и менингеальной лимфатической системами.
Схематическое отображение связи между глимфатической системой, ответственной за отвод интерстициальной жидкости из паренхимы ЦНС в спинномозговую жидкость, и обнаруженной нами системой менингеальных лимфатических сосудов.

Оригинал статьи

Перевод: Татьяна Харьковская, Татьяна Юзвинкевич

Источники:

  1. Ransohoff, R. M. & Engelhardt, B. The anatomical and cellular basis of immune surveillance in the central nervous system. Nature Rev. Immunol. 12, 623635 (2012).
  2. Kipnis, J., Gadani, S. & Derecki, N. C. Pro-cognitive properties of T cells. Nature Rev. Immunol. 12, 663669 (2012).
  3. Shechter, R., London, A. & Schwartz, M. Orchestrated leukocyte recruitment to immune-privileged sites: absolute barriers versus educational gates. Nature Rev. Immunol. 13,206218 (2013).
  4. Goldmann, J. et al. T cells traffic from brain to cervical lymph nodes via the cribroid plate and the nasal mucosa. J. Leukoc. Biol. 80, 797801 (2006).
  5. Kaminski, M. et al. Migration of monocytes after intracerebral injection at entorhinal cortex lesion site. J. Leukoc. Biol. 92, 3139 (2012).
  6. Engelhardt, B. & Ransohoff, R. M. The ins and outs of T-lymphocyte trafficking to the CNS: anatomical sites and molecular mechanisms. Trends Immunol. 26, 485495 (2005).
  7. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nature Med. 17, 13711380 (2011).
  8. Wang, Y. & Oliver, G. Current views on the function of the lymphatic vasculature in health and disease. Genes Dev. 24, 21152126 (2010).
  9. Baluk, P. et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J. Exp. Med. 204, 23492362 (2007).
  10. Kerjaschki, D. The lymphatic vasculature revisited. J. Clin. Invest. 124, 874877 (2014).
  11. Debes, G. F. et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunol. 6, 889894 (2005).
  12. Weber, M. et al. Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients.Science 339, 328332 (2013).
  13. Bazigou, E. et al. Integrin-α9 is required for fibronectin matrix assembly during lymphatic valve morphogenesis. Dev. Cell 17, 175186 (2009).
  14. Koina, M. E. et al. Evidence for lymphatics in the developing and adult human choroid. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 13101327 (2015).
  15. Johanson, C. E. et al. Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: new challenges in health and disease. Cerebrospinal Fluid Res. 5, 10 (2008).
  16. Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H.-Y. & Carare, R. O. Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease. Acta Neuropathol. 117, 114 (2009).
  17. Liu, N.-F., Lu, Q., Jiang, Z.-H., Wang, C.-G. & Zhou, J.-G. Anatomic and functional evaluation of the lymphatics and lymph nodes in diagnosis of lymphatic circulation disorders with contrast magnetic resonance lymphangiography. J. Vasc. Surg. 49, 980987 (2009).
  18. Girard, J.-P., Moussion, C. & Förster, R. HEVs, lymphatics and homeostatic immune cell trafficking in lymph nodes. Nature Rev. Immunol. 12, 762773 (2012).
  19. Weller, R. O., Galea, I., Carare, R. O. & Minagar, A. Pathophysiology of the lymphatic drainage of the central nervous system: implications for pathogenesis and therapy of multiple sclerosis. Pathophysiology 17, 295306 (2010).
  20. Mathieu, E., Gupta, N., Macdonald, R. L., Ai, J. & Yücel, Y. H. In vivo imaging of lymphatic drainage of cerebrospinal fluid in mouse. Fluids Barriers CNS 10, 35 (2013).
  21. Cserr, H. F., Harling-Berg, C. J. & Knopf, P. M. Drainage of brain extracellular fluid into blood and deep cervical lymph and its immunological significance. Brain Pathol. 2, 269276 (1992).
  22. Harris, M. G. et al. Immune privilege of the CNS is not the consequence of limited antigen sampling. Sci. Rep. 4, 4422 (2014).
  23. Laman, J. D. & Weller, R. O. Drainage of cells and soluble antigen from the CNS to regional lymph nodes. J. Neuroimmune Pharmacol. 8, 840856 (2013).
  24. Schneider, M., Ny, A., Ruiz de Almodovar, C. & Carmeliet, P. A new mouse model to study acquired lymphedema. PLoS Med. 3, e264 (2006).
  25. Kida, S., Pantazis, A. & Weller, R. O. CSF drains directly from the subarachnoid space into nasal lymphatics in the rat. Anatomy, histology and immunological significance. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 19, 480488 (1993).
  26. Xie, L. et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science 342, 373377(2013).
  27. Yang, L. et al. Evaluating glymphatic pathway function utilizing clinically relevant intrathecal infusion of CSF tracer. J. Transl. Med. 11, 107 (2013).
  28. Berton, M. et al. Generalized lymphedema associated with neurologic signs (GLANS) syndrome: A new entity? J. Am. Acad. Dermatol. 72, 333339 (2015).
  29. Akiyama, H. et al. Inflammation and Alzheimer’s disease. Neurobiol. Aging 21, 383421(2000).
  30. Hohlfeld, R. & Wekerle, H. Immunological update on multiple sclerosis. Curr. Opin. Neurol. 14,299304 (2001).

About The Author
editor