Микроорганизмы
0

Патогенез индуцированного гриппом острого респираторного дистресс-синдрома

by editorФевраль 12, 2016

Kirsty R Short, Edwin J B Veldhuis Kroeze, Ron A M Fouchier, Thijs Kuiken

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) — это летальное осложнение гриппа. В этом обзоре мы предлагаем комплексную модель его патогенеза. ОРДС включает в себя: повреждение эпителиального и эндотелиального компонентов аэро-гематического барьера легких (здесь и далее будет использоваться аббревиатура “АГБ”, под которой будет подразумеваться его эпителиальный и эндотелиальный компоненты — прим. редактора), просачивание жидкости в просвет альвеол, а также дыхательную недостаточность. Самая важная часть АГБ — это альвеолярный эпителий, клетки которого связаны плотными контактами. Именно эти клетки являются мишенью вируса гриппа, который подавляет в них активность натрий-калиевого насоса, повреждает плотные соединения, и в конечном счете приводит к гибели инфицированных клеток. Зараженные эпителиальные клетки продуцируют цитокины, которые привлекают лейкоциты — нейтрофилы и макрофаги — и активируют соседние эндотелиальные клетки. Активированные эндотелиальные клетки и проникшие лейкоциты стимулируют дальнейшую инфильтрацию, вместе с этим лейкоциты индуцируют продукцию активных форм кислорода и оксида азота, которые повреждают барьер. Активированные макрофаги также вызывают апоптоз эпителиальных клеток. Модель индуцированного гриппом ОРДС отлична от классической модели, центром которой является повреждение эндотелия, и приводит обоснования для терапевтического вмешательства с целью смягчения ответа организма при индуцированном вирусом гриппа ОРДС.

Введение

Вирус гриппа А — это респираторный патоген, который существенно влияет на здоровье человека во всем мире. В человеческой популяции циркулируют сезонные вирусы, которые вызывают ежегодные эпидемии, уносящие приблизительно 500000 жизней каждый год. Новый штамм вируса гриппа А, к которому популяция еще не приобрела иммунитет, может стать причиной глобальной пандемии с изменчивой смертностью; пандемический H1N1 2009 года вызвал 151700-575400 смертельных случаев в первый год циркуляции, в то время, как пандемический H1N1 1918 года привел более чем к 40 миллионам смертей. Существует опасение, что новые возникающие из животных-резервуаров штаммы вируса гриппа А (например, происходящие от птиц вирусы H5N1 и H7N9) могут приобрести высокую контагиозность у людей и вызвать серьезную пандемию. Чтобы смягчить тяжесть такой пандемии, следует понимать механизмы, путем которых грипп А вызывает респираторное заболевание.

Основное осложнение инфицирования вирусом гриппа — вирусная пневмония, которая часто происходит совместно или с последующей бактериальной пневмонией. В этом обзоре мы фокусируемся на первичной вирусной пневмонии, которая может привести к острому респираторному дистресс-синдрому (ОРДС). Клинически острая фаза ОРДС характеризуется цианозом, гипоксемией, отеком легких и нарастающей в течение долгого времени дыхательной недостаточностью, которые приводят к полиорганной недостаточности и высокой смертности (до 60%). Помимо вируса гриппа А к ОРДС могут привести другие нарушения, к примеру — сепсис, пневмония, травма и аспирация желудочного содержимого. Главной причиной дыхательной недостаточности в острую фазу ОРДС является повреждение АГБ, который обеспечивает газообмен (рисунок 1). Повреждение этого барьера приводит к заполнению просвета альвеол богатым белком экссудатом, который также содержит фибрин, эритроциты и воспалительные клетки. Эта отечная жидкость уменьшает альвеолярный газообмен и может приводить к тяжелой дыхательной недостаточности, как это было отмечено у пациентов с ОРДС.

Понимание механизмов повреждения АГБ в острую фазу ОРДС достигнуто в основном благодаря исследованиям бактериального сепсиса, при котором в первую очередь повреждается эндотелий. Эта модель может не подходить для вируса гриппа, который первым инфицирует эпителий. Кроме того, хотя некоторые обзоры фокусируются на различных факторах индуцированного вирусом гриппа повреждения легких (включая факторы вирулентности вируса, продукцию цитокинов и патологические изменения), нет такого обзора, который бы рассматривал все эти факторы в совокупности. Мы рассматриваем имеющуюся литературу о взаимодействии между вирусом гриппа А и ключевыми типами клеток, представленными в легочных альвеолах, в острой фазе ОРДС. В частности, мы обращаем особое внимание на роли эпителиальных и эндотелиальных клеток легких, нейтрофилов и макрофагов в повреждении АГБ, разрабатывая новую концептуальную основу для индуцированного гриппом ОРДС.

Эпителиальные клетки

В числе первых клеток, которые встречает вирус гриппа после входа в альвеолы — эпителиальные клетки, они же пневмоциты 1 или 2 типов. Пневмоциты 1 типа — это плоские клетки, покрывающие 95% поверхности альвеол и обеспечивающие легкую диффузию газа между воздухом в просвете альвеол и кровью в капиллярах. Пневмоциты 2 типа — кубические клетки, секретирующие легочный сурфактант, который важен для снижения альвеолярного поверхностного натяжения. Плотные контакты между эпителиальными клетками отвечают за снижение проницаемости эпителиального слоя альвеолярных клеток. Плотные контакты образованы различными белками, включающими клаудины и запирающие зоны 1, 2 и 3. Более 90% сопротивления транспорту белков через АГБ обусловлено альвеолярным эпителием. Ограничивая транспорт белка, эпителий поддерживает осмотическое давление по разные стороны барьера и предотвращает отек легких.

Второй механизм, с помощью которого альвеолярный эпителий предотвращает экссудацию жидкости в просвет альвеол, заключается во взаимодействии ионных каналов и мембранных белков, к которым относятся эпителиальные натриевые каналы (ENaCs), трансмембранный регулятор проводимости муковисцидоза и много различных аквапоринов. Наиболее хорошо описанными ионными каналами в легких являются ENaCs, которые присутствуют на апикальной поверхности пневмоцитов обоих типов. Этот канал дополняется Na+/K+ АТФазой на базолатеральной поверхности клетки. Ионы Na+, входящие в канал на апикальной поверхности клетки, перемещаются к базолатеральной поверхности, где Na+/K+ АТФаза выкачивает их в подлежащий интерстиций. Наличие Na+ в интерстиции создает осмотический градиент, который удаляет воду из просвета альвеол через аквапорины и внутриклеточные пути в альвеолярных эпителиальных клетках, тем самым предотвращая отек легких.

Пневмоциты являются не только важнейшим компонентом эпителиально-эндотелиального барьера, но также и клетками-мишенями вируса гриппа А. Вирус гриппа А связывается с клеткой-мишенью путем прикрепления вирусного гемагглютинина к сиалосахариду на поверхности клетки. Экспрессия сиалосахарида различна для различных пневмоцитов: пневмоциты 1 типа в основном экспрессируют α-2,6-связанные сиалосахариды, которые “предпочитают” вирусы гриппа человека, в то время как пневмоциты 2 типа экспрессируют в основном α-2,3-сцепленные сиалосахариды, которые “предпочитают” птичьи вирусы гриппа. Результаты вскрытий пациентов, погибших от гриппа H5N1, показали, что антигены вируса гриппа H5N1 наиболее часто встречались в пневмоцитах второго типа, что согласуется с данными о тропизме птичьих вирусов гриппа к α-2,3-сцепленным сиалосахаридам. Напротив, результаты вскрытия погибших в результате заражения пандемическим вирусом H1N1 2009 года (который имеет двойную тропность, к α-2,3-сцепленным и α-2,6-сцепленным сиалосахаридам) показали экспрессию антигенов пандемического вируса H1N1 в обоих типах пневмоцитов. Эти вирус-зависимые различия в прикреплении зависят от специфических аминокислотных остатков в рецептор-связывающем домене глобулярной головки гемагглютинина. Позиции 190 и 225 (вирус гриппа А Н1) и позиции 226 и 228 (вирусы гриппа А Н2 и Н3) являются основными детерминантами рецепторной специфичности пандемических вирусов гриппа. Мутации в этих позициях также определяют рецептор-связывающие свойства вируса гриппа А H5N1. Таким образом, тип клеток-мишеней альвеолярного эпителия может различаться у разных штаммов гриппа А.

Источник: журнал Lancet

Источник: журнал Lancet

Рисунок 1. Схематическое представление эпителиально-эндотелиального барьера дыхательных путей человека.

(А) В нижних дыхательных путях трахея разделяется на главные бронхи и несколько уровней бронхов и бронхиол, оканчиваясь терминальными бронхиолами.

(В) Каждая терминальная бронхиола содержит в ацинусе около 2000 альвеол. В стенках альвеол содержится сеть легочных капилляров, подающих кровь, приходящую из легочных артериол и дренируемую легочными венами.

(С) Каждая альвеола содержит несколько альвеолярных макрофагов и выстлана плоскими пневмоцитами 1 типа и кубическими пневмоцитами 2 типа. Пневмоциты лежат на базальной мембране, которая непосредственно примыкает или сливается с базальной мембраной легочных капилляров, которые выстланы эндотелиальными клетками.

(D) Газообмен между кровью в легочных капиллярах и воздухом в альвеолярном просвете происходит через АГБ, состоящий из альвеолярного эпителиального слоя, базальной мембраны или мембран и легочного эндотелиального слоя

(Е) Специфическое окрашивание на панкератин пневмоцитов 1 типа (стрелки в виде наконечника) и пневмоцитов 2 типа (обычные стрелки) в нормальных человеческих альвеолах (уменьшено на 13% от ×1000).

(F) Специфическое окрашивание на фактор фон Виллебранда эндотелиальных клеток капилляров (стрелка) в последовательном сечении ткани, показанной в разделе Е (уменьшено на 13% от ×1000).

БМ = базальная мембрана. ПК = плотный контакт.

Вскоре после инфицирования вирус гриппа А вызывает накопление жидкости в просвете альвеол путем прямого ингибирования ENaCs (рисунок 2). Экспозиция пневмоцитов типа 2 in-vitro по вирусу гриппа А/Пуэрто Рико/8/1934 (H1N1) в течение 1 часа уменьшила активность ENaC при сохранении целостности эпителия. Это уменьшение активности было связано с активацией протеинкиназы С и фосфолипазы вирусным гемагглютинином. Ионный канал вируса гриппа М2 также может ингибировать активность ENaCs на эпителиальных клетках, вызывая продукцию активных форм кислорода и последующую активацию протеинкиназы С. Крысы, инфицированные вирусом гриппа и затем получившие интратрахеально физиологический раствор, имели достоверно меньший клиренс жидкости из легких через два часа после заражения, чем неинфицированные крысы, что согласуется с вышеизложенными данными.

На более поздней стадии инфекции наиболее важную роль в повреждении АГБ путем разрушения эпителиального монослоя играет индуцированная вирусом гриппа А гибель эпителиальных клеток. В тканях пациентов, погибших от вызванного вирусом гриппа ОРДС наблюдались оба типа клеточной смерти — как апоптоз, так и некроз. Механизм, посредством которого вирус гриппа индуцирует клеточную смерть, был показан in vitro, хотя он типичнее для бронхиальных или бронхиолярных эпителиальных клеток, чем для альвеолярных эпителиальных клеток. Инфицирование линий человеческих бронхиолярных эпителиальных клеток (NCL-H292) рекомбинантным вирусом гриппа А/Англия/939/69 (H3N2) привело к каспаза-8-зависимому апоптозу. Вирус гриппа может индуцировать апоптоз эпителиальных клеток посредством разнообразных путей, включая активацию протеинкиназы R, которая впоследствии активирует проапоптозные гены (нап. FAS). Кроме того, вирусная нейраминидаза может приводить трансформирующий фактор роста β в его активную форму, которая затем индуцирует апоптоз путем взаимодействия с соответствующими рецепторами. Экспрессия неструктурного белка 1 (NS-1), полученного из вируса гриппа А/Гонконг/483/97 (H5N1), также достаточна, чтобы вызвать каспаза-зависимый апоптоз эпителиальных клеток. В отличие от индуцированного вирусом гриппа апоптоза клеток NCL-H292, заражение эмбриональных человеческих бронхиальных эпителиальных клеток адаптированным к мышам штаммом вируса гриппа А/Пуэрто Рико/8/1934 (H1N1) привело к некрозу. Вирусный полимеразный комплекс (в частности нуклеопротеин) может способствовать индуцированной вирусом гриппа клеточной смерти путем удаления кэп-структур мРНК клетки-хозяина (так называемый “захват кэпа”), что уменьшает количество кэпированной мРНК хозяина, которая может транслироваться с получением функциональных белков. Из-за важной роли эпителия в минимизации отека легких, утрата эпителиальных клеток в результате индуцированной вирусом гриппа клеточной смерти играет важную роль в повреждении структуры легких.

Источник: журнал Lancet

Источник: журнал Lancet

Рисунок 2. Роль альвеолярных эпителиальных и эндотелиальных клеток в ОРДС, индуцированном вирусом гриппа.
На ранних стадиях ОРДС, вирус гриппа А может ингибировать активность ENaCs (i) на альвеолярных эпителиальных клетках. Позднее вирус гриппа может вызывать апоптоз или некроз (ii) клеток альвеолярного эпителия, продукцию цитокинов (iii) и нарушение плотных контактов (iv). В конечном счете, эти изменения приводят к накоплению белоксодержащей жидкости в альвеолах (розовый). Специфическое окрашивание на нуклеопротеин гриппа А демонстрирует заражение гриппом А H5N1 (вставка) клеток альвеолярного эпителия (стрелка) легочной ткани человека через 24 часа (уменьшено на 22% от ×400). (B) После заражения вирусом гриппа А, эндотелиальные клетки капилляров позволяют экстравазацию моноцитов (v) и нейтрофилов (vi) в альвеолы посредством активации молекул адгезии, таких как Е-селектин и Р-селектин. На вставке показана адгезия нейтрофилов (стрелка) и других лейкоцитов к эндотелию кровеносного сосуда легких хорька, через 4 дня после заражения вирусом гриппа Н5N1 in-vivo (окрашивание гематоксилин-эозином, уменьшено на 22% от ×800). Эндотелий может продуцировать различные провоспалительные цитокины (vii) в ответ на грипп А. В обоих (А) и (В) эпителиальных клетках представлены оба типа пневмоцитов. ОРДС = острый респираторный дистресс синдром. БМ = базальная мембрана. Эр = эритроцит. ПК = плотный контакт. TNF = фактор некроза опухоли.

Воздействие гибели эпителиальных клеток на повреждение АГБ может быть усугублено способностью вируса гриппа повреждать плотные контакты между эпителиальными клетками. В частности, некоторые штаммы H5N1 могут непосредственно разрушать плотные контакты через представленный в консенсусной последовательности ESEV на карбоксильном конце вирусного NS-1 мотив, связывающий PDZ-лиганд. Эта последовательность опосредует прикрепление вирусного NS-1 к белкам хозяина, таким как scribble и DLG1, которые играют важную роль в формировании плотных контактов. Соответственно, заражение клеток собачьей почки Madin-Darby вирусом, обладающим мотивом ESEV, нарушает образование плотных контактов. Тем не менее, мотив ESEV экспрессируется не всеми штаммами вируса гриппа А. Таким образом, прямое нацеливание вирусного NS-1 на плотные контакты происходит не во всех случаях заражения вирусом гриппа.

Наконец, зараженные вирусом гриппа эпителиальные клетки продуцируют цитокины, которые могут впоследствии повредить АГБ. Посмертный анализ летального случая пневмонии, вызванной вирусом гриппа H5N1, показал продукцию фактора некроза опухоли α (TNFα) альвеолярными эпителиальными клетками. По данным исследования in-vitro, инфицированные вирусом гриппа альвеолярные эпителиальные клетки продуцируют и другие цитокины помимо TNFα (таблица 1). Как правило, к данным исследований in-vitro необходимо относиться с осторожностью, так как результаты могут меняться в зависимости от штамма вируса гриппа и типа используемых клеток, а также потому, что во многих исследованиях используются эмбриональные клетки или клеточные линии, полученные из трахеи, бронхов или бронхиол (вместо альвеолярных). По результатам исследований на зародышевых человеческих пневмоцитах 2 типа можно предположить, что увеличение продукции CXCL10, интерлейкина 6 и CCL5 после заражения H5N1 (по сравнению с заражением сезонным штаммом H1N1) может способствовать увеличению тяжести заболевания. Однако механизм, посредством которого те или иные цитокины повреждают АГБ, остается неясным. Интерлейкин 1β и подобные ему цитокины могут подавлять активность ENaC. Плотные контакты могут разрушаться под действием таких цитокинов, как TNFα. Кроме того, некоторые цитокины, продуцируемые альвеолярными эпителиальными клетками в ответ на заражение вирусом гриппа, функционируют как хемоаттрактанты, либо могут повышать экспрессию молекул клеточной адгезии на эндотелиальных клетках легких и, таким образом, обеспечивать выход лейкоцитов из сосудов. Впоследствии эти клетки могут повреждать АГБ.

Таблица 1. Продукция цитокинов различными типа клеток после заражения эпителиальных клеток вирусом гриппа А. *Определяется экспрессией мРНК. TNF = фактор некроза опухоли.

Таблица 1. Продукция цитокинов различными типа клеток после заражения эпителиальных клеток вирусом гриппа А.
*Определяется экспрессией мРНК. TNF = фактор некроза опухоли.

Эндотелиальные клетки

Эндотелиальные клетки — наиболее распространенный тип клеток в легких, составляющий 30% от общего количества клеток. В альвеолах эндотелиальные клетки покрывают изнутри капилляры, которые формируют сеть в стенках альвеол. Своей апикальной стороной эндотелиальные клетки находятся в непосредственном контакте с циркулирующей кровью и формируют участок прикрепления для рекрутированных воспалительных клеток. После соответствующей активации, эндотелиальные клетки экспрессируют молекулы клеточной адгезии, которые связываются с родственными им лигандами на лейкоцитах и опосредуют выход лейкоцитов из сосудов. Своей базолатеральной стороной эндотелиальные клетки лежат на базальной мембране, которая тесно соединена (или даже сливается) с эпителиальной базальной мембраной. Это тесное взаимодействие предполагает, что эндотелиальные клетки подвержены сильному влиянию сигналов и вирусных частиц, высвобождаемых из эпителиальных и воспалительных клеток в просвет альвеол. Активация эндотелия этими сигналами и вирусными частицами — необходимое звено эффективного иммунного ответа против гриппа А. Однако в то же время активация эндотелия может играть роль в повреждении АГБ и способствовать отёку легких.

Заражение вирусом гриппа может активировать экспрессию молекул адгезии эндотелиальных клеток (к примеру — Е-селектин, Р-селектин, ICAM1 и VCAM1), тем самым обеспечивая проникновение лейкоцитов в альвеолы (рисунок 2). Присутствие большого количества нейтрофилов и макрофагов может повреждать АГБ посредством различных механизмов. Заражение вирусом гриппа А H5N1 приводит к более высокой экспрессии Е-селектина и Р-селектина на эндотелиальных клетках человека, нежели чем заражение пандемическим H1N1 1918 года или сезонным штаммом H1N1. Эта разница в активации эндотелия может помочь объяснить увеличение привлечения лейкоцитов, которое происходит при заражении вирусом гриппа H5N1 и сопровождается возрастающим повреждением альвеол. Заражение вирусом гриппа может также вызывать продукцию цитокинов эндотелиальными клетками легких. Сезонные вирусы H3N2 и H1N1 вызывают продукцию интерлейкина 6, CXCL9 и CXCL 10 эндотелиальными клетками пупочной вены человека, в то время как заражение вирусом H5N1 может вызвать продукцию CXCL10, TNFα и интерлейкина 6. В исследованиях на мышах было показано, что индуцированная вирусом гриппа активация легочного эндотелия увеличивает тяжесть заболевания у мышей, инфицированных пандемическим вирусом H1N1 2009 года или сезонным вирусом H1N1. В частности, легочный эндотелий продуцировал цитокины, такие как CCL2, CXCL10, интерферон α, TNFα и интерферон γ в ответ на вирус гриппа А и рекрутировал лейкоциты в легкие в течение инфекции. Соответственно, ингибирование продукции цитокинов эндотелием и накопления лейкоцитов в результате лечения агонистом сфингозин-1-фосфата значительно улучшило выживаемость после инфицирования вирусом гриппа. К сожалению, механизм, посредством которого цитокины эндотелиального происхождения могут повреждать АГБ при заражении вирусом гриппа, остается неизвестен. Тем не менее, эти данные подчеркивают важную роль, которую играет активация эндотелия в индуцированном вирусом гриппа повреждении альвеол.

Вирус гриппа А может также повреждать АГБ, заражая непосредственно эндотелиальные клетки, вызывая их гибель и, таким образом, создавая достаточное для развития отека легких повреждение эндотелия. In vitro наличие многоосновного участка рестрикции в геммаглютинине позволяет вирусу H5N1 продуктивно реплицироваться в эндотелиальных клетках. У домашних птиц геммаглютинины с многоосновным участком рестрикции обеспечивают системную репликацию вируса, поскольку эти геммаглютинины могут быть расщеплены экспрессируемыми повсеместно протеазами, в отличие от геммаглютининов с одноосновными участками рестрикции, которые зависят от трипсиноподобных протеаз, экспрессируемых только в дыхательных путях и желудочно-кишечном тракте. Однако эндотелиальный слой играет не такую важную роль в предотвращении выхода жидкости из просвета сосуда в просвет альвеолы, как эпителиальный слой. Вместе с базальной мембраной эндотелиальный слой обеспечивает лишь 10% от сопротивления к транспорту белка (который поддерживает осмотическое давление) через АГБ. Таким образом, изолированное повреждение эндотелиального слоя не является ключевой причиной отека легких.

Нейтрофилы

Нейтрофилы прибывают в легочные альвеолы в течение первого дня заражения вирусом гриппа, где они присоединяются к резидентным лейкоцитам, таким как альвеолярные макрофаги. Нейтрофилы — недолго живущие фагоцитирующие гранулоциты, которые в ответ на провоспалительную стимуляцию просачиваются через стенку сосуда из крови в просвет альвеолы. Экстравазация нейтрофилов происходит в несколько шагов: роллинг по эндотелию, сцепление с адгеринами и селектинами эндотелиальных клеток, миграция через эпителиальный и эндотелиальный слои в альвеолярный просвет. Эта миграция может вызвать временное, но недостаточное для развития отека легких, повреждение АГБ.

После попадания в просвет альвеолы нейтрофилы активируются в ответ на местно представленные цитокины и патогены. Активированные нейтрофилы могут фагоцитировать патогены. В результате, фагосомы могут сливаться с цитоплазматическими первичными, вторичными и третичными гранулами, которые содержат токсичные соединения, уничтожающие фагоцитированные патогены. Эти токсичные соединения могут быть выбрасываться наружу после контакта с неперевариваемым материалом (например, иммунными комплексами, осажденными на базальной мембране), фагоцитоза мембранолитических веществ (например, кристаллов уратов) или слияния гранул с фагосомой прежде, чем она полностью закроется. В дополнение к фагоцитозу, нейтрофилы могут ловить и убивать патогены, формируя нейтрофильные внеклеточные ловушки (NETs), которые состоят из внеклеточной ДНК, обсемененной гистонами, хроматином и антимикробными соединениями. Важность нейтрофилов в ограничении репликации и распространения вируса гриппа отражает тот факт, что мыши с дефицитом нейтрофилов имели высокие титры вируса в легких и других органах и тканях в сравнении с контрольными мышами.

Тем не менее, нейтрофилы могут также играть важную роль в повреждении АГБ. В случаях ОРДС у человека, концентрации нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа положительно коррелировали с тяжестью заболевания. Подобным образом, повреждение легких у зараженных вирусом гриппа мышей снизилось при блокировке накопления нейтрофилов в легких. Хотя было предложено несколько механизмов, путем которых нейтрофилы могут повреждать АГБ при ОРДС, лучше всего описаны механизмы, основанные на способности нейтрофилов продуцировать активные формы кислорода, цитокины и выбрасывать NETs (рисунок 3).

Нейтрофилы могут продуцировать активные формы кислорода (например супероксид) посредством НАДФ-оксидазы, многокомпонентного ферментативного комплекса, состоящего из белков в цитозоле и цитохрома b558 на мембране вторичных гранул. Результатом слияния вторичных гранул с фагосомами или клеточной мембраной является продукция активных форм кислорода в фагосоме или внеклеточной среде. Соответственно, активные формы кислорода могут не только уничтожать патогены, такие как вирус гриппа, но также и повреждать альвеолы. В соответствии с этим представлением, устранение супероксида (путем инъекции супероксид дисмутазы) предотвращает летальный исход инфекции гриппа у мышей. Точно также заражение вирусом гриппа вызывает меньшие повреждения тканей у дефицитных по НАДФ-оксидазе мышей, чем у мышей дикого типа.

Источник: журнал Lancet

Источник: журнал Lancet

Рисунок 3. Роль нейтрофилов и макрофагов в индуцированном вирусом гриппа ОРДС.
(А) Нейтрофилы могут повредить аэро-гематический барьер (АГБ) при заражении вирусом гриппа посредством продукции активных форм кислорода (i). В ответ на заражение вирусом гриппа нейтрофилы также продуцируют цитокины (ii), которые могут затем опосредованно повредить АГБ. Производство NETs (iii) может также повредить эпителиальные и эндотелиальные клетки. На вставке показаны NETs (стрелка) в крупных кровеносных сосудах мыши после заражения вирусом гриппа in-vivo (окрашивание гематоксилин-эозином).

(В) Макрофаги могут повредить АГБ посредством индуцированной гриппом экспрессии TRAIL, который взаимодействует с DR5 (iv), вызывая апоптоз эпителиальных клеток. Экспрессия TRAIL инициируется интерфероном β. В ответ на вирус гриппа макрофаги также продуцируют различные цитокины (v), которые могут косвенно повредить АГБ. На вставке показаны макрофаги (стрелка) взаимодействующие с эпителиальными клетками альвеол легочной ткани человека через 24 часа после заражения ex-vivo вирусом гриппа A H5N1 (окрашивание гематоксилин-эозином, уменьшено на 33% от ×500).

В конечном результате грипп А индуцирует опосредованную макрофагами продукцию NO (vi) и последующее образование пероксинитрита, которые могут повредить АГБ. В обоих (А) и (В) эпителиальных клетках представлены оба типа пневмоцитов. Вновь рекрутированные макрофаги изображены темно-розовыми, резидентные альвеолярные макрофаги изображены зеленым. Накопление экссудата в альвеолах показано розовым.

ОРДС = острый респираторный дистресс синдром. БМ = базальная мембрана. АФК = активные формы кислорода. НВЛ = нейтрофильная внеклеточная ловушка. ФНО = фактор некроза опухоли. NO = оксид азота. DR5 = рецептор смерти 5. TRAIL = фактор некроза опухоли связанный с апоптоз-индуцирующим лигандом. Вставка части iii воспроизведена Narasaraju и коллегами с разрешения Elsevier.

Миелопероксидаза представлена в первичных гранулах и создает условия для продукции хлорноватистой кислоты из перекиси водорода и свободных ионов хлора. Взаимодействуя с маннозными рецепторами макрофагов, миелопероксидаза может спровоцировать высвобождение макрофагами активных форм кислорода и цитокинов. Эти эффекты могут не только инактивировать вирус гриппа, но и вызвать повреждение АГБ. Соответственно, заражение вирусом гриппа в меньшей степени приводит к разрушению легочной структуры и отеку легких у миелопероксидаза-дефицитных мышей, чем у мышей дикого типа. Кроме того, миелопероксидаза-дефицитные мыши также демонстрируют повышенную экспрессию клаудина 9 и клаудина 18-1. Эти данные позволяют предположить, что миелопероксидаза может привести к повреждению АГБ путем разрушения плотных контактов. Все еще не выяснено, какую роль индуцированное миелопероксидазой повреждение играет в формировании смертности по причине инфекции вирусом гриппа. Хотя выживаемость мышей дикого типа не отличалась от таковой у зараженных большой дозой вируса Mpo -/- мышей, у дефицитных мышей имелась тенденция к длительному выживанию при более низкой дозе.

Нейтрофилы могут опосредованно повреждать АГБ путем продукции цитокинов. Инфицирование вирусом гриппа побуждает нейтрофилы к продукции CXCL2 и интерлейкина 8, которые рекрутируют дополнительные нейтрофилы к инфицированной области. Также после заражения вирусом гриппа нейтрофилы становятся основными продуцентами CXCL10. Инфицирование вирусом гриппа вызывает меньшие легочные повреждения и смертность у CXCL10-дефицитных мышей, чем у мышей дикого типа. Выделяемый нейтрофилами CXCL10 может действовать аутокринным образом и связываться с рецепторами CXCR3, которые экспрессируются на нейтрофилах. Этим путем CXCL10 индуцирует генерацию супероксида и усиливает хемотаксис по направлению к CXCL2. В соответствии с этим, лечение хорьков антагонистом Cxcr3 снижает тяжесть клинических проявлений вирусной инфекции H5N1.

Нейтрофилы также могут повреждать АГБ за счет производства NETs. У мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Пуэрто Рико/8/1934, нейтрофильные внеклеточные ловушки формировались и прикреплялись к эндотелию в областях кровоизлияний, как в просвете альвеол, так и в терминальных бронхиолах в областях повреждения тканей. Эти результаты свидетельствуют о том, что NETs могут повреждать как эпителиальные, так и эндотелиальные клетки альвеол. Роль вируса гриппа в продукции нейтрофильных внеклеточных ловушек in vivo была подтверждена экспериментами in vitro, путем ко-инкубации нейтрофилов и инфицированных вирусом гриппа эпителиальных клеток. Однако выживаемость мышей, дефицитных по пептидиларгининдезиминазе 4 (ферменту, который необходим для формирования NETs) после заражения вирусом гриппа в основном не отличается от мышей дикого типа; предполагается, что формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек может не быть критичным для повреждения АГБ.

Макрофаги

Как и нейтрофилы, макрофаги — это важный компонент врожденного иммунного ответа, направленного против вируса гриппа. Макрофаги поглощают патогены и инфицированные, либо апоптотические клетки. Фагоцитированные патогены затем уничтожаются посредством респираторного взрыва и продукции активных форм кислорода, либо оксида азота. Макрофаги могут также производить широкий спектр как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов. В пределах альвеол следует различать два типа макрофагов. Первый тип — альвеолярные макрофаги, которые являются длительно живущими резидентными клетками, которые встречаются до 7 на альвеолу. Они, как правило, несут альтернативно активируемый фенотип, минимизирующий воспаление легких в ответ на безвредные патогены, защищая при этом легкое от более вирулентных возбудителей. Их значение в контроле за инфицированием вирусом гриппа подтверждается тем фактом, что удаление альвеолярных макрофагов до инфицирования вирусом гриппа приводит к повышению вирусной репликации и утяжелению заболевания. При вызванной вирусом гриппа инфекции моноциты, привлекаемые в альвеолы хемокинами (например, CCL2, CCL5 и CXCL10), вскоре значительно превосходят альвеолярные макрофаги в количестве. Эти моноциты мигрируют из крови в просвет альвеол, где они дифференцируются в макрофаги. Этот второй тип макрофагов — недавно рекрутированные макрофаги — обычно несет классически активированный фенотип. Хотя блокировка пополнения рядов моноцитов в легком приводит к увеличению репликации вируса, недавно рекрутированные макрофаги также могут играть важную роль в повреждении АГБ. После инфицирования вирусом гриппа, у мышей с дефицитом CCR2 (рецептора для CCL2, который опосредует хемотаксис моноцитов) уменьшались как привлечение моноцитов в легкие, так и тяжесть легочных поражений. Основные механизмы повреждения недавно рекрутированными макрофагами связаны с высвобождением апоптоз-индуцирующего лиганда, связанного с фактором нероза опухоли (TRAIL, также известного как TNFSF10), продукцией оксида азота и провоспалительных цитокинов (рисунок 3).

После заражения вирусом гриппа А/Пуэрто-Рико/8/1934 недавно рекрутированные макрофаги экспрессировали TRAIL, который взаимодействует с рецептором смерти 5, белком, который активируется на альвеолярных эпителиальных клетках инфицированных вирусом гриппа; такое взаимодействие индуцировало апоптоз этих клеток. Соответственно, ингибирование TRAIL снижало скорость апоптоза эпителиальных клеток, степень отека легких и смертность мышей, инфицированных вирусом гриппа А. Продукция TRAIL зависит от активации вирусом гриппа А протеинкиназы R и последующего производства интерферона β. Аутокринное взаимодействие интерферона β со своим рецептором (рецептором интерферонов α, β, и ω) вызывает производство TRAIL JAK–STAT-зависимым образом. В соответствии с этим путем, блокировка сигнала интерферона β у мышей нарушает продукцию TRAIL и снижает повреждение альвеолярного эпителия после инфицирования вирусом гриппа.

Макрофаги и, в меньшей степени, нейтрофилы, которые стимулируются провоспалительными цитокинами, экспрессируют индуцибельную NO-синтазу (NOS2), которая опосредует образование оксида азота. Оксид азота может комбинироваться с супероксидом, формируя пероксинитрит, который может как убивать патогены, так и повреждать клетки. Ингибирование активности NOS2 сокращает масштабы пневмонии и смертность после летальной инфекции вирусом гриппа. Эти данные согласуются с данными о том, что, в отличие от мышей дикого типа, у NOS2-дефицитных мышей после инфицирования вирусом гриппа не развивалась пневмония. Karupiah и коллеги предположили, что экспрессия NOS2 вносит больший вклад в тяжесть пневмонии, чем в цитопатический эффект вируса гриппа, поскольку увеличение титров вируса у NOS2-дефицитных мышей путем блокирования интерферона γ все же не вызывает летального исхода. Результаты этого исследования подчеркивают важность повреждения легких, индуцированного оксидом азота при заражении вирусом гриппа.

Макрофаги могут продуцировать широкий спектр цитокинов в зависимости от штамма вируса гриппа и типа макрофага. Важность этих цитокинов для защиты от вирусов гриппа доказана тем фактом, что вирусные NS-1 действуют на нескольких уровнях, служа препятствием продукции интерферонов и интерферон-опосредованной индукции противовирусных белков. К примеру, мутация Asp92Glu в NS-1 превращает вирус гриппа А H5N1 в относительно нечувствительный к интерферону α, интерферону γ и TNFα. Однако, как правило, заражение макрофагов вирусом H5N1 приводит к синтезу более разнообразного репертуара цитокинов в более высоких концентрациях, чем при заражении другими штаммами вируса гриппа А. Несмотря на то, что эта индукция является важным компонентом противовирусного ответа, она также может способствовать гиперцитокинемии и последующей легочной дисфункции, отмеченной в некоторых случаях заболевания людей вирусом гриппа H5N1. Человеческие макрофаги моноцитарного происхождения, возможные представители недавно рекрутированных макрофагов, производят значительно более высокие концентрации провоспалительных цитокинов ,чем человеческие альвеолярные макрофаги при инфицировании вирусом гриппа ex-vivo. Потому опосредованное макрофагами, цитокин-индуцированное повреждение легких, может происходить в основном благодаря недавно рекрутированным макрофагам. Тем не менее, множественность ролей цитокинов при инфекции вирусом гриппа и значительная избыточность их сигнальных путей приводят к противоречивым выводам из экспериментального заражения вирусом гриппа мышей, дефицитных по специфическим цитокинам. Остается неясным то, какие индуцированные макрофагами цитокины наиболее важны в повреждении АГБ, является ли это повреждение прямым или непрямым и, собственно, механизм этого повреждения.

Таблица 2. Продукция цитокинов после заражения гриппом А моноцитарными клетками и альвеолярными макрофагами человека. *Определяется экспрессией мРНК. TNF = фактор некроза опухоли.

Таблица 2. Продукция цитокинов после заражения гриппом А моноцитарными клетками и альвеолярными макрофагами человека.
*Определяется экспрессией мРНК. TNF = фактор некроза опухоли.

Заключение и перспективы

В этом обзоре мы обозначили основные типы клеток и механизмов, вовлеченных в поражение легких вирусом гриппа, которые ведут к следующей модели индуцированного вирусом гриппа повреждения АГБ (рисунок 4). При входе в альвеолы, вирус гриппа заражает свою основную мишень — эпителиальные клетки, которые претерпевают апоптоз или некроз, нарушая целостность эпителиального слоя. Инфицированные вирусом гриппа эпителиальные клетки также продуцируют цитокины (например CCL2, CCL5, and CXCL10), которые рекрутируют нейтрофилы и моноциты в альвеолы путем хемотаксиса. Активация инфицированных вирусом гриппа эндотелиальных клеток приводит к повышению экспрессии молекул адгезии для экстравазации лейкоцитов и продукции цитокинов, таких как CCL2, CXCL10, интерферон α, интерлейкин 6, TNFα и интерферон γ. Оба процесса дополнительно привлекают макрофаги и нейтрофилы в альвеолы. Рекрутированные нейтрофилы продуцируют активные формы кислорода, которые могут вызвать повреждение тканей. Нейтрофилы также, в ответ на заражение вирусом гриппа, продуцируют цитокины. В частности, продукция CXCL10 может повредить АГБ, спровоцировав выработку супероксида или усилив хемотаксис нейтрофилов. Рекрутированные макрофаги могут повреждать АГБ тремя путями. Во-первых, они могут экспрессировать TRAIL, который взаимодействует с рецептором смерти 5 на эпителиальных клетках и индуцирует апоптоз эпителиальных клеток. Во вторых, за счет активации NOS2, рекрутированные макрофаги могут повышать концентрации оксида азота и пероксинитрита, которые вызывают повреждение тканей. В-третьих, они являются важными производителями провоспалительных цитокинов, которые еще больше усугубляют воспалительный ответ и могут повредить эпителиально-эндотелиальный барьер.

Патогенез индуцированного вирусом гриппа ОРДС сосредоточен на альвеолярном эпителии. Этот подход контрастирует с классической моделью патогенеза ОРДС, в которой основной мишенью считался эндотелий сосудов легких. Важной причиной ОРДС в классической модели считался бактериальный сепсис, который отличается от заражения вирусом гриппа по двум важным критериям. Во-первых, типовой патологический агент при сепсисе — липополисахарид — попадает в альвеолы посредством кровотока, в то время как вирус гриппа проникает туда через дыхательные пути. Во-вторых, основной мишенью липополисахарида является клетка эндотелия, в то время как для вируса это клетка эпителия. Неудивительно, что в старых моделях так много внимания было уделено клеткам эндотелия: на многих моделях для изучения патогенеза ОРДС использовали именно липополисахарид. Независимо от того, был ли ОРДС вызван сепсисом, респираторным вирусом или же другим патогеном, его патогенез в основном зависит от повреждения альвеолярного эпителия, который является основным барьером, поддерживающим разность осмотического давления по разные стороны АГБ.

Источник: журнал Lancet

Источник: журнал Lancet

Рисунок 4. Модель патогенеза и гистопатология индуцированного вирусом гриппа ОРДС.
(А) Схематическая модель патогенеза ОРДС индуцированного вирусом гриппа. В здоровых легких просвет альвеол свободен от жидкости, что обеспечивает оптимальный газообмен (верхний правый квадрант). После инфицирования, вирус гриппа А индуцирует клеточную смерть, что приводит к экссудации белоксодержащей жидкости в просвет альвеол (верхний правый квадрант). Вирус гриппа также индуцирует продукцию цитокинов эпителиальными и эндотелиальными клетками и повышение экспрессии селектина на эндотелиальных клетках. Повышение экспрессии селектина эндотелиальными клетками допускает экстравазацию нейтрофилов, которые являются первыми среди клеток рекрутируемых в легкие при заражении вирусом гриппа (нижний левый квадрант). Нейтрофилы повреждают аэро-гематический барьер (АГБ) посредством токсических гранул и продукции цитокинов, что приводит к увеличению экссудации белоксодержащей жидкости в альвеолярное пространство. Повышение экспрессии селектина на эндотелиальных клетках допускает экстравазацию макрофагов, которые повреждают АГБ посредством продукции NO, TRAIL и цитокинов (верхний левый квадрант). В дополнение к белковой жидкости и лейкоцитарной инфильтрации, прогрессирующее повреждение АГБ приводит к осаждению фибрина и кровоизлияниям в просвете альвеол.

(В) Гистопатологический препарат показывает характерные этапы ОРДС в легких хорька через 4 дня после заражения вирусом гриппа А H5N1. Верхний правый квадрант демонстрирует нормальные, заполненные воздухом альвеолы неинфицированного хорька. Нижний правый квадрант показывает альвеолы обильно заполненные экссудатом, визуализируемые как розовый гомогенный материал (стрелка). Нижний левый квадрант демонстрирует альвеолы с экссудатом, который смешан с инфильтрировавшими лейкоцитами, главным образом — нейтрофилами (стрелка). Верхний левый квадрант показывает альвеолы, заполненные экссудатом, смешанным с макрофагами, эритроцитами и нитями фибрина. Кроме того, альвеолярные стенки разрушены (окрашивание гематоксилин-эозином, уменьшено на 24% от x400).

ОРДС = острый респираторный дистресс синдром. IAV = вирус гриппа А. NO = оксид азота. TRAIL = фактор некроза опухоли связанный с апоптоз-индуцирующим лигандом.

Эта новая модель индуцированного вирусом гриппа ОРДС применима для изучения его патогенеза: как для идентификации тем, представляющих особый интерес, так и для обнаружения “белых пятен” в наших знаниях. Возможно ли воплотить эту модель, данные для которой были получены из различных источников, в единую экспериментальную систему? Путем каких механизмов вирус гриппа индуцирует гибель клеток альвеолярного эпителия? Какие факторы определяют наступление апоптоза или некроза? Как этот механизм зависит от типа клеток (например пневмоцитов 1 или 2 типа)? Путем каких механизмов цитокины, продуцируемые эпителиальными клетками, эндотелиальными клетками и недавно рекрутированными макрофагами, повреждают АГБ? Каковы самые важные механизмы, посредством которых активируются эндотелиальные клетки: прямой контакт с вирусом, продукция цитокинов инфицированными вирусом гриппа эндотелиальными клетками или продукция цитокинов другими типами клеток? На какой стадии повреждения АГБ частицы вируса гриппа выбрасываются в большой круг кровообращения и от каких факторов зависит их выход? Любое ли поражение вирусом гриппа повреждает базальную мембрану? Если да, то как? Какое влияние оказывает это повреждение на реэпителизацию? Какие характеристики индуцированного вирусом гриппа повреждения альвеолярного эпителия определяют, произойдет ли реэпителизация либо фиброз? Как вышеуказанные механизмы различаются среди различных штаммов вируса гриппа? Какие факторы хозяина определяют, разовьется ли у пациента ОРДС? Как разница в основной цели (эпителий или эндотелий), для ОРДС, индуцированного вирусом гриппа, и ОРДС, индуцированного сепсисом, отражается на прогрессировании заболевания, ответе на вмешательство или клиническом исходе? Данные о том, что пациенты с индуцированным сепсисом ОРДС имеют более высокие концентрации прокальцитонина и интерлейкина 6 на 1-2 день после диагностики ОРДС, более тяжелое течение болезни и более высокую смертность, чем пациенты с не-септическим ОРДС говорят в пользу предположения о том, что различные причины ОРДС могут приводить к различным клиническим результатам.

Описанная в этом обзоре модель также обеспечивает возможность выбора оптимальной терапевтической мишени для минимизации повреждения тканей в ответ на поражение легочных альвеол вирусом гриппа. Потенциальные терапевтические мишени для индуцированного вирусом гриппа ОРДС — альвеолярный эпителий, инфильтрирующие лейкоциты и общий провоспалительный ответ. Факторы роста, такие как фактор роста кератиноцитов и фактор роста гепатоцитов, помогают защитить и восстановить альвеолярный эпителий. Ингибиторы оси CXCL10–CXCR3 снижают инфильтрацию нейтрофилами и индукцию производства активных форм кислорода. Апокинин, ингибитор НАДФ оксидазы 2, также снижает продукцию активных форм кислорода. Целекоксиб и месалазин, ингибиторы ЦОГ-2, снижают дисфункцию цитокинов и предотвращают апоптоз. Гемифиброзил, агонист пероксисомного активирующего пролиферацию рецептора α, снижает выделение провоспалительных цитокинов. Мезенхимальные стволовые клетки сдерживают воспалительный ответ, улучшают клиренс альвеолярной жидкости и поддерживают целостность легочного эпителия и эндотелия при пневмонии. Стволовые клетки легких быстро распространяются в области повреждения альвеол и экспрессируют характерные для альвеол маркеры, после сублетального заражения мышей вирусом гриппа. Понимание сигналов, которые запускают пролиферацию и распространение этих клеток и наблюдаемую регенерацию альвеолярных структур может быть полезно для разработки новых методов лечения индуцированного вирусом гриппа ОРДС. Кроме того, терапия должна способствовать реэпителизации в отсутствие широко распространенного фиброза (который может привести к снижению функции легких и повышению зависимости от ИВЛ). Тем не менее, процедуры, которые ограничивают индуцированное вирусом гриппа повреждение у мышей, могут не обладать эквивалентными эффектами у людей. Следовательно, в профилактике повреждения альвеол вирусом гриппа необходим подход, который сочетает в себе знания полученные в ходе экспериментального заражения лабораторных животных с клиническими данными.

Индуцированный вирусом гриппа ОРДС имеет высокую летальность, несмотря на интенсивную терапию, стратегии вентиляционной защиты легких и использование экстракорпоральной мембранной оксигенации. Терапевтических методик, направленных против вируса зачастую недостаточно для того, чтобы вылечить болезнь, потому что повреждения легких, остающиеся после вирусной инфекции, слишком серьезны, чтобы разрешиться самостоятельно. Только благодаря лучшему пониманию механизмов развития повреждения и репарации могут быть разработаны терапевтические стратегии для улучшения исхода данного трудноизлечимого осложнения гриппа.

Перевод: Елена Лисицына

Изображения: Елена Лисицына, Антон Осипенко

Редакция: Азат Муртазин, Михаил Гусев, Станислав Груздев

Оригинал

About The Author
editor