Клиническая химия: углеводы
Автор: Екатерина Слотина
Редакция: Елена Бреславец, Никита Чуев

Всеми нами обожаемая с первого курса биохимия по сути своей является сухим остатком от дисциплины, именуемой клинической химией. Клиническую химию чаще всего в ВУЗах изучают в контексте пропедевтики на курсах, когда, казалось бы, физиология и биохимия уже освоены, а весь спектр возможных болезней еще только предстоить изучить. Все мы задавались вопросом, когда учили гликолиз и глюконеогенез: зачем это все? Зачем мне эти знания, если я хочу быть врачом? А затем, в конце методичке или учебника мелким шрифтом зеленым цветом рядом с эскулапом можно было увидеть клинический комментарий, который хоть как-то намекал на то, что эти знания могут пригодиться в дальнейшем. Еще меньше времени уделяется в ВУЗах самим методам диагностики. Поэтому сегодня речь пойдет не о гликолизе и глюконеогенезе, а о том, что должно было остаться в голове студентов после курса биохимии. 

Краткий экскурс в физиологию и в регуляцию уровня глюкозы в крови (для тех, кто забыл или никогда не знал): бета-клетки островков Лангерганса поджелудочной железы вырабатывают инсулин, ускоряющий поступление глюкозы в клетки печени, жировой ткани и мышц. Альфа-клетки тех же островков синтезируют глюкагон, стимулирующий гликогенолиз и глюконеогенез в печени и почках. Дельта-клетки поджелудочной железы вырабатывают соматостатин, ингибирующий альфа- и бета- клетки. На метаболизм глюкозы оказывают влияния также адреналин, кортизол и гормоны роста. Адреналин тормозит поступление глюкозы в клетки печени, жировой ткани и мышц, а также совместно с кортизолом усиливает гликогенолиз и глюконеогенез в печени и почках. Гормон роста оказывает влияние исключительно ингибирующее действие на процессы поступления глюкозы в клетки печени, жировой ткани и мышцы. 

Как вы можете догадаться при нарушении баланса этих гормонов ничего хорошего не произойдет. Под «ничего хорошего» мы подразумеваем в первую очередь диабет. 

Про диабет вам еще полсотни раз расскажут на внутренних болезнях. Для нас сегодня важно только лишь знать, что под этим понятием подразумевают около 30 болезней, которые характеризуются хронической гипергликемией, абсолютной или относительной инсулиновой недостаточностью. Это состояние как правило приводит к нарушению функции сосудов и нервной системы. Первый (5%) и второй тип (90%) диабета являются соответственно самыми частыми формами этого заболевания. 

Диабет первого типа является HLA-DR-4 и HLA-DR-3 – ассоциированным заболеванием, относящихся к группе аутоимунных болезней. Под влиянием факторов окружающей среды запускаются аутоимунные процессы, приводящие к нарушению функции вышеуказанных бета-клеток поджелудочной железы и таким образом к абсолютной инсулиновой недостаточности. 

При диабете второго типа в начале патогенеза всегда стоит метаболический синдром, под которым понимают совокупность факторов риска, в первую очередь, потребление организмом большого количества калорий в виде глюкозы и жиров. Из-за повышенной концентрации этих веществ, организм вырабатывает больше инсулина. В результате этого клеткам больше не нужно большое количество рецепторов, из-за чего количество последних уменьшается. И, несмотря на достаточное количество инсулина в крови, этого количества не хватает, чтобы рецепторы активировались, и глюкоза поступала из крови в клетки. Это состояние именуют относительной инсулиновой недостаточностью. С возрастом риск развития болезни повышается. Наследственный фактор также играет не последнюю роль. 

Под «другими специфическими типами диабета» понимают различные формы этого заболевания, при которых в результате генетических нарушений поражаются бета-клетки поджелудочной железы, рецепторы инсулина или по-другим причинам вся система дает сбой. Например, в результате поражений экзокринной части поджелудочной железы под медикаментозным или химическим воздействием. Вирусы также могут поражать бета-клетки. К генетическим причинам относят аутосомно-доминантно передаваемый MODY (maturity onset diabetes in young), обусловленный шестью разными дефектами, например в факторе РТА-1-alpha или в ферменте глюкокиназе. 

Многие эндокринные нарушения также приводят к гипергликемии: например, болезнь Кушинга, акромегалия, феохромоцитома и гипертиреоз.Поджелудочная железа также поражается в результате панкреатита, опухолей, травм, иссечения и гемохроматоза, что также может приводить к увеличению глюкозы в крови. Гипергликемия часто развивается на фоне инфаркта и инсульта под действием адреналина. 

Диагноз «diabetes mellitus» ставят при концентрации конъюгированного гемоглобина в крови HbA1C более 48 миллимоль в литре крови, что составляет около 6,5% от количества всего гемоглобина ИЛИ при концентрации глюкозы в крови более 11,1 ммоль/л (200 мг/дл) ИЛИ при концентрации глюкозы в крови натощак (более 8 часов) более 7 ммоль/л (126 мг/дл). 

Главными критериями для постановки диагноза являются концентрация глюкозы в крови натощак и результат перорального глюкозотолерантного теста.

Для диабета первого типа характерно также помимо результатов лабораторного исследования наличие таких симптомов как полиурия, полидипсия, снижение веса. Еще до появления вышеуказанных симптомов в крови обнаруживаются аутоантитела GADA (антитела, направленные против фермента глутаматдекарбоксилазы) и IA-2 (антитела, направленные против тирозифосфатазы). 

International Diabetes Foundation в 2006 году установили критерии «метаболического синдрома». Под них попадает увеличение обхвата талии у мужчин более 94 см, у женщин более 80 см, а также наличие двух критериев из нижеперечисленных: 

1. Концентрация триглицеридов более 1,7 ммоль/л 
2. Концентрация HDL-холестерина менее 1,03 ммоль/л у мужчин и менее 1,29 ммоль/л у женщин 
3. Систолическое давление более 130 мм.рт.ст. , а диастолическое более 85 мм.рт.ст 
4. Концентрация глюкозы в крови более 5,6 ммоль/л натощак 
А также наличие у пациента уже установленного диабета второго типа.


Представим себе случай: женщина с диабетом второго типа просыпается рано утром с чувством гипогликемии. Выпивает 2 стакана лимонада. Поскольку через час ей надо ехать ко врачу, чтобы случайно за рулем не ощутить слабость из-за гипогликемии, она не колет себе утреннюю порцию инсулина и приезжает к вам на прием. По результатам анализа крови Вы устанавливаете у нее гипонатриемию. Однако прочитав этот пост и добросовестно отучившись в медицинском университете, вы знаете, что при повышении глюкозы в крови, из-за ее осмотического действия, молекулы воды поступают в кровеносное русло, что снижает концентрацию натрия в крови. Организм же через некоторое время начнет хотеть в туалет, что вновь нормализует концентрацию. Важно помнить, что тот же самый эффект наблюдается при парентеральном введении глюкозы. 

Все мы видели эти маленькие приборчики для измерения глюкозы в крови. Кровь из капилляров чаще всего перемешивается с ингибиторами гликолиза (фторид натрия, монойодацетат, манноза, глицериновый альдегид и имид малеина). Если же кровь взята из вены (например при определении концентрации глюкозы в крови натощак) необходимо максимум через 30 минут отделить плазму от эритроцитов. Даже при применении фторида натрия уже в первый час после забора крови концентрация глюкозы в крови падает на 10% в изъятой пробе, после чего в течение суток концентрация не изменяется. 

Стоит отметить, что концентрация глюкозы в крови в артериальной и венозной крови неодинакова, также как и концентрация ее в плазме и эритроцитах. Натощак разница составляет около 10% и более в обоих случаях. 

Следует помнить следующий ряд: 

Концентрация глюкозы: Плазма крови в капиллярах > цельная кровь в капиллярах > плазма крови в венах > цельная кровь в венах. 

Эта разница легко объяснима: органы и ткани потребляют глюкозу из артериальной крови, а также сами эритроциты способны исключительно на гликолиз для поддержания собственно гомеостаза. Также существует большая разница в концентрации белков в плазме и в самих эритроцитах. В эритроцитах концентрация белков больше и таким образом меньше воды, чем в плазме крови снаружи, поэтому и меньше объема растворителя, который может занять глюкоза. 


Американское общество диабетологов ADА уже давно рекомендует использовать исключительно плазму венозной крови для контроля уровня глюкозы в крови, однако с 1997 года ВОЗ постепенно вводит эту рекомендацию. Проблема заключается в том, что до сих пор не существует достаточно быстрых ингибиторов гликолиза для цельной крови, а также часто в клинической практике довольно трудно осуществить цетрифугирование крови через полчаса после ее забора. Поэтому эти маленькие приборчики и стали так распространены. С их помощью можно изменять уровень глюкозы в крови несколько раз в день и сравнивать результаты. Однако поставить диагноз, основываясь только на данных этих маленьких приборчиков невозможно. 

Итак, что же делает этот маленький прибор? Метод основан на глюкозооксидазной рекции. При контакте глюкозы с кислородом воздуха при участии воды и фермента глюкооксидазы образуется глюконат и пероксид водорода. Пероксид водорода, участвуя в реакции с хромогенным веществом, при участии фермента пероксидазы вызывает изменения цвета субстрата. Этим хромогенным веществом могут быть о-дианисидин, п-аминофеназон или –фенол, системы на основе йодидов и молибдатов. Реакция очень специфическая, однако возможно возникновение ошибок при наличии в крови восстанавливающих веществ, например, аскорбиновой кислоты. 



Следующий метод основан на реакции, катализируемой ферментом дегидрогиназой: этот энзим окисляет глюкозу при участии НАД до глюконолактона с образованиям НАДН+Н+. Последний детектируется оптическими методами при длине волны 340 нм. Дегидрогеназа способна катализировать только превращение бета-D-глюкозы в лактон, поэтому в реакционной смеси также содержится мутаротаза. Этот тест также является очень специфическим, однако возможны ошибки при наличии высокого уровня ксилулозы в крови. 



Гексокиназная реакция также применяется в диагностике. При участии АТФ гексокиназа переводит глюкозу в глюкозо-6-фосфат (первая реакция гликолиза) и АДФ. Глюкозо-6-фосфат также подвергается окислению с участием НАДФ при участии фермента дегидрогеназы с образованием соответствующего лактона. Надо отметить, что в эритроцитах, использующих гликолиз как основной источник энергии также содержится глюкозо-6-фосфат, поэтому часто результаты этого теста получаются завышенными. Удаление белков из пробы при этом методе должно быть проведено с помощью перхлората, а не при помощи трихлоруксусной кислоты, так как последняя ингибирует дегидрогеназу. 

Современные технологии работают по следующему принципу: окисление дегидрогеназой глюкозы до лактона приводит к реакции восстановления пирролохининолактона. Последний принимает электроны и переносит их на гексаноферрат. Последний восстанавливается в результате этой реакции, а потом снова окисляется на электроде. В зависимости от концентрации глюкозы регистрируется разность потенциалов. 



Гипогликемия (<2,5 ммоль/л) чаще всего является результатом передозировки инсулина или других антидиабетических средств, а также в результате развития опухолей (инсулинома, гиперплазия бета-клеток поджелудочной железы, полиаденоматоз). Причиной также могут является эндокринные нарушения (недостаточность гипофиза, болезнь Аддисона, гипотиреоз, недостаточность глюкагона). Физиологически гипогликемия может наступить после изнуряющего физического труда, во время поста, а также при нарушении всасывания глюкозы в кишечнике. Еще реже причиной являются врожденные заболевания: гликогеноз первого типа (Гирке), недостаточность лактазы, непереносимость фруктозы. Последние случае часто сопряжены с тяжелыми нарушениями печеночной функции. Передозировка пропанололом и салицилатами также может быть причиной гипогликемии. Алкоголь также тормозит глюконеогенез в печени, что объясняет более сильное опьянение при выпивании его натощак. 

Определение концентрации глюкозы в моче имеет свои особенности. Для элиминации глюкозы почками характерна ее нелинейная зависимость от концентрации глюкозы в крови. Концентрация в плазме крови должна достичь определенного порогового значения (8-10 ммоль/л или 145-180 мг/дл),  чтобы начался процесс выведения избыточной глюкозы из организма. Наличие глюкозы в крови может быть свидетельством диабета или же нарушения функции почек. Обычно для теста используют обычную порцию утренней мочи. Причем рекомендуется хранить пробу не более двух часов вне зависимости от окружающей температуры.

Реакция, протекающая для определения концентрации глюкозы в крови нам уже известна: в данном случае также применяется глюкозооксидазный метод. Обычно краситель наносится на полоску, которая опускается на некоторое время в емкость с мочой. В зависимости от концентрации глюкозы краситель меняет свой цвет. В современных лабораториях также стоят приборы, которые позволяют отказаться от часто применяемой еще в отделении методики определения интенсивности цвета «на глаз». Обычно на полоске полей несколько: одно из них фиксирует глюкозу в концентрации до 500 мг/дл, а другое – от 1 г до 5 г/дл. Это позволяет точнее определить интервал, в котором находится та или иная проба. Важно отметить, что присутствие в пробе большого количества аскорбиновой кислоты, которая вызывает искажение результатов (ложно низкие показатели). Поэтому часто на применяемой полоске есть отдельное поле, покрытое йодидом или молибдатом, предотвращающими влияние аскорбиновой кислоты. При положительном результате, мочу анализируют отдельно на предмет наличия в ней высоких концентраций аскорбиновой кислоты (чаще отдельное поле все на той же тестовой полоске). Глюкооксидаза также очень чувствительна к перепадам кислотности среды. В сильно кислой моче (например pH<5 при кетоацидозе) фермент работает медленнее. В последнем случае прибегают к использованию других ферментов, также описанных в предыдущем посте.



Нормой считается концентрация глюкозы в моче не превышающая 0,8 ммоль/л или 15 мг/дл
. При результате более 2,2 ммоль/л или 40 мг/дл рекомендуется проведение других тестов, чтобы подтвердить диагноз.

Стоит отметить, что необходимо различать гипер- и нормогликемическую (почечную) глюкозурию. В последнем случае снижение порогового значение может быть вызвано токсическим или метаболическим поражением почечных канальцев, а также во время беременности. У пациентов на протяжении долгого времени страдающих от диабета наблюдается увеличение порогового значения, что тоже необходимо учитывать.

Следующим важным диагностическим методом является глюкозотолератный тест. Его используют для диагностики диабета при пограничных результатах других тестов, для диагностики диабета беременных, нормогликемической глюкозурии.  К противопоказаниям относят уже диагностированный диабет, ацидоз, кетонурию, гипокалиемию, гипомагнезиэмию, заболевания ЖКТ, а также нарушения моторики и всасывания веществ в ЖКТ, гепатит, гипертермические состояния, а также тест должен быть проведен минимум за или после трех дней с момента менструации. 

Перед тестом рекомендуют три дня употреблять пищу, насыщенную углеводами (более 250 г в день), не принимать лекарственные средства (салицилаты и диуретики), а также за 10-16 часов не есть и не упортеблять спиртных напитков.



Сперва проводят забор крови натощак, потом пациент должен употребить 75 г глюкозы в виде олигосахаридов лучше в утренние часы (дети: 1,75г глюкозы на килограмм веса, не более 75г). Забор крови проводится через 1-2 часа. В это время пациент не должен есть и пить, а также подвергаться физическим нагрузкам.

Согласно современным рекомендациям подозрение на диабет ставят при концентрации глюкозы в плазме крови более 11,1 ммоль/л или 200 мг/дл через 2 часа после начала теста. Показатели от 7,8 до 11,1 ммоль/л или 140-199 мг/дл характеризуют как сниженную толерантность к глюкозе. Риск развития диабета у таких пациентов составляет 1-5% на протяжении года.



Рекомендуют также проведение теста парентально из-за его более высокой чувствительности. В настоящее время его проводят при болезнях ЖКТ, если предполагают, что быстрая эвакуация желудочного содержимая и нарушения встасывания могут существенно повлиять на оральный тест. При этом тесте 20 минут после парентерального введения глюкозы пациенту вводят толбутамид или инсулин и производят 15-30 заборов крови в последующие 3 часа.Этот тест позволяет также выявить чувствительность организма к инсулину. В иностранной литературе такой тест называют Frequently Sampled Intravenous Glucose Tolerance Test (FSIGT).

Для определения резистентности к инсулину используют такие тесты как HOMA, Cederholm-Wibell, Sturmvoll.

Следующим показателем, о котором будет идти речь являются гликозилированные продукты. Чаще всего ими являются протеины, которые присоединяют глюкозу (неферментативно! Для сдающих биохимию: гликозилирование протекает под воздействием ферментов) сначала образуя альдимин, а затем в результате перегруппировки Амадори, кетимины. Это перераспределение осуществляется в гемоглобине на N-терминальном конце бета-протеиновой цепи на аминокислоте валин. Образующееся соединение носит название HbA1c. Это гликирование вызывает изменение структуры гемоглобина и смещение его изоэлектрического пункта. У здорового человека доля такого гемоглобина не превышает 5%. На концевой валин часто присоединяются фруктозо-1,6-дифосфат, а также глюкозо-6-фосфат. Такой гемоглобин относится к фракции HbA1a и составляет около 0,4% от всего гемоглобина.



Гемоглобин HbA1b образуется в результате деамидирования гемоглобина HbA1c и составляет 0,5% от общего числа. Другие протеины также подвергаются гликированию: особенно те, что долго пребывают в плазме крови. Например, альбумин, циркулирует в плазме крови более 20 дней.  Для определение гликированного гемоглобина используют кровь, смешанную с ЭДТА или гепарином. Такой раствор может храниться при комнатной температуре 3 дня или в холодильнике до 1 недели. В лаборатории используют метод ионнообменной хроматографии для гемоглобина HbA1a-c, а также метод аффинной хроматографии. Поскольку в крови все еще присутствует альдиминовая нестабильная фракция гликированного гемоглобина, ее необходимо сначала элиминировать из пробы с помощью хлорида натрия.


Глюкоза связывается с белками необратимо. Таким образом судя по строению белков и их обновлению в разных клетках организма можно судить о протекании гиперкликемии. Результат теста из плазмы крови дает право судить о состоянии организма 5-15 минут назад, проба мочи – 5-6 часов назад, концентрация фруктозамина – 2-3 недели назад, HbA1c – 6-8 недель назад, гликированные белки волос и ногтей – 1-2 года назад, белки в клетках почек и сетчатки – 5-8 лет назад.

Этот параметр также позволяет судить о соответствии терапии диабета. Оптимальным считается концентрация HbA1c у людей страдающих диабетом менее 7% (у людей младше 65 лет: 6,5%), о декомпенсации же говорят при >12%. Последний результат требует возможного изменения терапии.  Невозможно полагаться этот параметр для диагностики диабета у больных гемолитической анемией, так как при этом заболевании снижена продолжительность жизни эритроцита, а значит и гемоглобина. Длительный прием витаминов С и Е ингибирует процесс гликирования. При почечной недостаточности результаты могут быть завышены, так как образуется карбаметилированный гемоглобин. Концентрация повышается также при употреблении алкоголя, высоких доз ацетилсалициловой кислоты, бета-лактамных антибиотиков, при длительной хронической железодифецитной анемии, а также тяжелой гипертриглицеридэмии. У новорожденных в крови высока концентрация HbF, что делает невозможным применение метода ионнгообменной хроматографии. Плазмоцитома и гемоглобинопатии так же могут влиять на результаты теста. 


Источник

Taschenlehrbuch Klinische Chemie und Hämatologie. Klaus Dörner, 8. издание. Thieme, 2013 год