Генная терапия, или Как загнать ДНК в клетку и вылечить этим пациентов
Автор: old.medach.pro
  С каждым годом появляется всё больше статей о медицинских клинических исследованиях, в которых, так или иначе, применялось лечение, основанное на введении различных генов – генная терапия. Это направление выросло из таких хорошо развивающихся разделов биологии, как молекулярная генетика и биотехнология. Зачастую, когда обычные (консервативные) методы уже перепробованы, именно генная терапия может помочь пациентам выжить и даже полностью выздороветь. Например, это касается наследственных моногенных заболеваний, то есть таких, которые вызваны дефектом в одном-единственном гене, а также и многих других . Или, к примеру, генная терапия может выручить и спасти конечность тем больным, у которых сужен просвет сосудов в нижних конечностях и вследствие этого развилась стойкая ишемия окружающих тканей, то есть эти ткани испытывают сильный недостаток питательных веществ и кислорода, которые в норме разносятся кровью по организму . Хирургическими манипуляциями и лекарствами таких пациентов лечить зачастую не получается, зато если локально заставить клетки выбрасывать наружу больше белковых факторов, которые повлияли бы на процесс образования и прорастания новых сосудов, то ишемия стала бы гораздо менее выраженной и жить больным станет гораздо легче. Генную терапию сегодня можно определить как лечение заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты совсем недавно – 22 мая 1989 года в целях диагностики рака. Первым наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммуннодефицит . С каждым годом число успешно проведенных клинических испытаний лечения различных заболеваний с использованием генной терапии растёт, и к январю 2014 г. достигло 2 тысяч . Итак, мы определились, что данное лечение основано на том, что если какие-то ткани организма испытывают недостаток некоторых отдельных белковых факторов, то это можно исправить введением в эти ткани соответствующих генов, кодирующих белки, и всё станет более или менее замечательно. Сами белки вводить не получится, потому что наш организм тут же среагирует неслабой иммунной реакцией, да и длительность действия была бы недостаточной. Теперь следует определиться с методом доставки гена в клетки.

Трансфекция клеток

Для начала стоит ввести определения некоторых терминов. Транспорт генов осуществляется благодаря вектору – это молекула ДНК, используемая как «транспортное средство» для искусственного переноса генетической информации в клетку. Выделяют множество разновидностей векторов: плазмидные, вирусные, а также космиды, фазмиды, искусственные хромосомы и т.д. Принципиально важно, что векторы (в частности, плазмидные) обладают характерными для них свойствами: 1. Точка начала репликации (ori) – последовательность нуклеотидов, с которой начинается удвоение ДНК. Если векторная ДНК не сможет удваиваться (реплицироваться), то необходимый лечебный эффект не будет достигнут, потому что она просто быстро расщепится внутриклеточными ферментами-нуклеазами, а из-за недостатка матриц будет в итоге образовано гораздо меньше молекул белка. Следует отметить, что эти точки специфичны для каждого биологического вида, то есть если векторную ДНК предполагается получать путём её размножения в культуре бактерий (а не просто химическим синтезом, что обычно гораздо дороже), то потребуются отдельно две точки начала репликации – для человека и для бактерий; 2. Сайты рестрикции – специфические короткие последовательности (чаще палиндромные), которые узнаются специальными ферментами (эндонуклеазы рестрикции) и разрезаются ими определённым образом – с образованием «липких концов». Эти сайты необходимы для того, чтобы сшить векторную ДНК (которая, по сути, является «болванкой») с нужными терапевтическими генами в единую молекулу. Такая сшитая из двух или нескольких частей молекула зовётся «рекомбинантной»; 3. Понятно, что нам желательно бы получить миллионы копий рекомбинантной молекулы ДНК. Опять-таки, если мы имеем дело с культурой клеток бактерий, то далее эту ДНК нужно выделить. Проблема заключается в том, что далеко не все бактерии проглотят нужную нам молекулу, некоторые не станут этого делать. Чтобы эти две группы всё-таки различить, в векторную ДНК вставляют селективные маркёры – участки устойчивости к определённым химическим веществам; теперь если в среду добавить эти самые вещества, то выживут только те, которые обладают устойчивостью к ним, а остальные погибнут. Все эти три составляющие можно наблюдать и в самой первой искусственно синтезированной плазмиде: PBR322_plasmidCC_BY-SA_3_0   Сам процесс внедрения плазмидного вектора в определённые клетки называется трансфекцией. Плазмида – это довольно короткая и обычно кольцевая молекула ДНК, которая находится в цитоплазме бактериальной клетки. Плазмиды не связаны с бактериальной хромосомой, они могут реплицироваться независимо от нее, могут выбрасываться бактерией в окружающую среду или, наоборот, поглощаться (процесс поглощения – трансформация). С помощью плазмид бактерии могут обмениваться генетической информацией, например, передавать устойчивость к определённым антибиотикам. Плазмиды существуют в бактериях в естественных условиях. Но никто не может помешать исследователю искусственно синтезировать плазмиду, которая будет обладать нужными для него свойствами, вшить в нее ген-вставку и внедрить в клетку. В одну и ту же плазмиду можно вшивать разные вставки .

Методы генной терапии

Существует два основных подхода, различающиеся природой клеток-мишеней: 1. Фетальная, при которой чужеродную ДНК вводят в зиготу (оплодотворённую яйцеклетку) или эмбрион на ранней стадии развития; при этом ожидается, что введённый материал попадёт во все клетки реципиента (и даже в половые клетки, обеспечив тем самым передачу следующему поколению). В нашей стране она фактически запрещена ; 2. Соматическая, при которой генетический материал вводят уже родившемуся в неполовые клетки и он не передаётся половым клеткам. Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных (размноженных) и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в определённые ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения лёгочных заболеваний (муковисцидоз, рак лёгких). Разработке программы генной терапии предшествует много этапов. Это и тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена (т. е., синтеза на матрице гена какого-то белка в определённой ткани), и идентификация первичного биохимического дефекта, и исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола.

Прямая доставка и клеточные носители терапевтических генов

Существует множество методов внедрения чужеродной ДНК в эукариотическую клетку: некоторые зависят от физической обработки (электропорация, магнетофекция и т.д.), другие – от применения химических материалов или биологических частиц (например, вирусов), которые используются как переносчики. Сразу стоит оговориться, что обычно комбинируются химические и физические методы (например, электропорация + окутывание ДНК липосомами). Прямые методы 1. Трансфекция на химической основе может быть классифицирована на несколько видов: с использованием вещества циклодекстрина, полимеров, липосом или наночастиц (с или без химической или вирусной функционализации, т.е. модификации поверхности): а) Один из самых дешевых методов – использование фосфата кальция. Он повышает эффективность включения ДНК в клетки в 10-100 раз. ДНК образует с кальцием прочный комплекс, что обеспечивает его эффективное поглощение. Недостаток – ядра достигает всего около 1 – 10% ДНК. Метод используется in vitro для переноса ДНК в клетки человека: img9_15 б) Применение сильноразветвленных органических молекул – дендример, для связывания ДНК и переноса её в клетку: 5в) Очень эффективным методом для трансфекции ДНК является внедрение её через липосомы – малые, окруженные мембраной тельца, которые могут сливаться с клеточной цитоплазматической мембраной (ЦПМ), представляющая собой двойной слой из липидов. Для эукариотических клеток трансфекция производится эффективнее с применением катионных липосом, потому что клетки к ним более чувствительны. Процесс имеет своё название – липофекция. Этот метод сегодня считается одним из самых безопасных. Липосомы нетоксичны и неиммуногенны. Однако, эффективность переноса генов с помощью липосом ограничена, поскольку внесенная ими ДНК в клетках обычно сразу же захватывается лизосомами и разрушается. Введение ДНК в клетки человека с помощью липосом сегодня является главным при терапии in vivo: 3 г) Еще один метод – использование катионных полимеров, таких как диэтиламиноэтил–декстран или полиэтиленимин. Отрицательно заряженные молекулы ДНК связываются с положительно заряженными поликатионами, и этот комплекс далее проникает в клетку путём эндоцитоза. ДЭАЭ-декстран изменяет физические свойства плазматической мембраны и стимулирует поглощение этого комплекса клеткой. Главный недостаток метода заключается в том, что ДЭАЭ-декстран в высоких концентрациях токсичен. Метод не получил распространения в генотерапии; д) С помощью гистонов и других ядерных белков . Эти белки, содержащие много положительно заряженных аминокислот (Lys, Arg), в естественных условиях помогают компактно уложить длинную цепь ДНК в сравнительно небольшое ядро клетки. 2. Физические методы: а) Электропорация – очень популярный метод; мгновенное повышение проницаемости мембраны достигается за счет того, что клетки подвергаются коротким воздействиям интенсивного электрического поля. Показано, что в оптимальных условиях количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. На человеке на сегодняшний день не используется. 4 б) «Cell squeezing» – метод, изобретенный в 2013 г. Он позволяет доставить молекулы в клетки путём "мягкого сдавливания" клеточной мембраны. Метод исключает возможность токсичности или неправильного попадания по мишени, так как он не зависит от внешних материалов или электрических полей; в) Сонопорация – метод искусственного переноса чужеродных ДНК в клетки с помощью воздействия на них ультразвуком, вызывающим открывание пор в клеточной мембране; г) Оптическая трансфекция – метод, при котором производится крошечное отверстие в мембране (около 1 мкм в диаметре) при использовании сильносфокусированного лазера; д) Гидродинамическая трансфекция – метод доставки генетических конструкций, белков и т.д. путем контролируемого повышения давления в капиллярах и межклеточной жидкости, что вызывает кратковременное повышение проницаемости клеточных мембран и образование в них временных пор. Осуществляется быстрой инъекцией в ткань, доставка при этом является неспецифичной. Эффективность доставки для скелетной мышцы – от 22 до 60% ; е) Микроинъекция ДНК – введение в ядро клетки животных с помощью тонких стеклянных микротрубочек (d=0,1-0,5 мкм). Недостаток – сложность метода, высока вероятность разрушения ядра либо ДНК; можно трансформировать ограниченное число клеток. Не используется для человека. 3. Методы на основе частиц. а) Прямой подход к трансфекции – генная пушка, при этом ДНК сцепляют в наночастицу с инертными твердыми веществами (чаще золото, вольфрам), которая затем «выстреливает» направленно в ядра клеток-мишеней. Этот метод применяется in vitro и in vivo для введения генов, в частности, в клетки мышечных тканей, например при таком заболевании, как миодистрофия Дюшена. Размеры частиц золота – 1-3 мкм.   1 б) Магнитофекция - метод, использующий силы магнетизма для доставки ДНК в клетки-мишени. Сначала нуклеиновые кислоты (НК) ассоциируются с магнитными наночастицами, а далее, под действием магнитного поля, частицы загоняются в клетку. Эффективность почти 100%-ная, отмечена явная нетоксичность. Уже через 10-15 мин частицы регистрируются в клетке – это гораздо быстрее других методик. в) Импалефекция (impalefection; "impalement", букв. "сажание на кол" + "infection") – метод доставки с применением наноматериалов, таких как углеродные нанотрубки и нановолокна. При этом клетки буквально протыкаются подстилкой из нанофибрилл . Приставка «нано» применяется для обозначения их очень маленьких размеров (в пределах миллиардных долей метра). 460px-Green4 Отдельно стоит выделить такой метод, как РНК-трансфекция: в клетку доставляется не ДНК, а молекулы РНК – их «преёмники» в цепи биосинтеза белка; при этом активизируются специальные белки, разрезающие РНК на короткие фрагменты -- т.н. малые интерферирующих РНК (миРНК). Эти фрагменты связываются с другими белками и, в конце концов, это приводит к угнетению экспрессии клеткой соответствующих генов. Таким образом можно заблокировать в клетке действие тех генов, которые потенциально на данный момент приносят больше вреда, чем пользы. Широкое применение РНК-трансфекция нашла, в частности, в онкологии. Основные принципы доставки генов с использованием плазмидных векторов рассмотрены. Теперь можно перейти к рассмотрению вирусных методов. Вирусы – это неклеточные формы жизни, чаще всего представляющие собой молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), обёрнутой в белковую оболочку. Если вырезать из генетического материала вируса все те последовательности, которые вызывают возникновение заболеваний, то весь вирус также можно успешно превратить в «транспортное средство» для нашего гена. Процесс внедрения ДНК в клетку, опосредованное вирусом, называется трансдукцией. На практике чаще всего используют ретровирусыаденовирусы и аденоассоциированные вирусы (AAV). Для начала стоит разобраться, каким должен быть идеальный кандидат для трансдукции среди вирусов. Критерии таковы, что он должен быть: • стабилен; • ёмок, то есть вмещать достаточное количество ДНК; • инертным в отношении метаболических путей клетки; • точным – в идеале, должен встраивать свой геном в конкретный локус генома ядра хозяина и др. В реальной жизни очень сложно скомбинировать хотя бы несколько пунктов, так что обычно выбор происходит при рассмотрении каждого индивидуального случая в отдельности. Из всех трёх перечисленных наиболее используемых вирусов самыми безопасными и одновременно самыми точными являются AAV. Их почти что единственный недостаток – сравнительно малая ёмкость (ок. 4800 п.н.), которая, однако, оказывается достаточной для многих генов . Помимо перечисленных методов достаточно часто генная терапия применяется в комбинации с клеточной: при этом сначала в питательную среду высаживают культуру определённых клеток человека, после этого тем или иным способом внедряют в клетки нужные гены, некоторое время культивируют и снова пересаживают в организм хозяина. В результате клеткам можно вернуть их нормальные свойства. Так, к примеру, модифицировали белые клетки крови человека (лейкоциты) при лейкемии: 2

Судьба гена после его попадания в клетку

Так как с вирусными векторами всё более-менее ясно в силу их свойства более эффективно доставлять гены до конечной цели – ядра, то остановимся на судьбе плазмидного вектора. На данном этапе мы добились того, что ДНК прошла первый большой барьер – цитоплазматическую мембрану клетки. Далее, в комплексе с другими веществами, оболочкой или без, ей необходимо достигнуть клеточного ядра, чтобы специальный фермент – РНК-полимераза – синтезировала молекулу информационной РНК (иРНК) на матрице ДНК (этот процесс называется транскрипция). Только после этого иРНК выйдет в цитоплазму, образует комплекс с рибосомами и согласно генетическому коду синтезируется полипептид – например, фактор роста сосудов (VEGF), который начнёт выполнять определённую терапевтическую функцию (в данном случае – запустит процесс образования ветвлений сосудов в ткани, подверженной ишемии). Что касается экспрессии введенных генов в требуемом типе клеток, то эта задача решается с помощью регуляторных элементов транскрипции. Ткань, в которой происходит экспрессия, часто определяется комбинацией специфичного для этой ткани энхансера(«усиливающей» последовательности) с определенным промотором (последовательность нуклеотидов, с которой РНК-полимераза начинает синтез), который может быть индуцируемым . Известно, что активность генов можно модулировать in vivo внешними сигналами, а так как энхансеры могут работать с любым геном, то в вектора можно вводить еще инсуляторы, которые помогают энхансеру работать независимо от его положения и могут вести себя как функциональные барьеры между генами. Каждый энхансер содержит набор участков связывания активирующих или супрессирующих белковых факторов . С помощью промоторов можно также регулировать уровень экспрессии генов. Например, есть металлотионеиновые или температурочувствительные промоторы; промоторы, управляемые гормонами. Экспрессия гена зависит от его положения в геноме. В большинстве случаев существующие вирусные методы приводят лишь к случайному встраиванию гена в геном. Чтобы исключить такую зависимость, при конструировании векторов снабжают ген известными нуклеотидными последовательностями, которые позволяют гену экспрессироваться независимо от места его встраивания в геном. Наиболее простой путь регуляции экспрессии трансгена – это обеспечение его индикаторным промотором, который чувствителен к физиологическому сигналу, такому, как выделение глюкозы или гипоксия. Такие «эндогенные» контролирующие системы могут быть полезны в некоторых ситуациях, таких, как осуществление глюкозозависимого контроля продукции инсулина. Более надежны и универсальны «экзогенные» системы контроля, когда экспрессия гена контролируется фармакологически введением маленькой лекарственной молекулы. В настоящее время известны 4 основные системы контроля - регулируемые тетрациклином (Tet), стероидом насекомых, экдизоном или его аналогами, антипрогестиновым препаратом майфпристоном (RU486) и химическими димеризаторами, такими, как рапамицин и его аналоги. Все они включают лекарственно зависимое привлечение домена активации транскрипции к основному промотору, ведущему нужный ген, но отличаются по механизмам этого привлечения .

Заключение

Обзор данных позволяет прийти к заключению, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivoи in vitro векторные системы далеки от совершенства . Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем – стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность – все еще нуждаются в серьезных доработках. Прежде всего, это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительному пребыванию внутри ядер). В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время. Генная и клеточная терапия открывает блестящие перспективы для восстановления утраченных клеток и тканей и генно-инженерного конструирования органов, что, несомненно, существенно расширит арсенал методов для медико-биологических исследований и создаст новые возможности для сохранения и продления жизни человека .

Перевод изображений: Денис Докучаев

Автор: Азат Муртазин

Блог автора: http://old.streamf.livejournal.com/

Список литературы: 1.  Stefano Ferrari E. A., Griesenbach U. Progress and Prospects: Gene Therapy Clinical Trials (Part 1). Gene Therapy (2007) 14, 1439–1447; doi:10.1038/sj.gt.3303001 2. Плотников М.В., Ризванов А.А., Масгутов Р.Ф., Мавликеев М.О. Первый клинический опыт применения прямой генной терапии VEGF иbFGF при лечении пациентов с критической ишемией нижних конечностей. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012 3. Culver K.W. Gene Therapy: A Handbook for Physicians. N.Y.: May Ann Liebert Inc. Publ., 1994. 117 p. 4. Torrecilla J. et al. Lipid Nanoparticles as Carriers for RNAi against Viral Infections: Current Status and Future Perspectives. BioMed Research International Volume 2014 (2014), Article ID 161794, 17 pages 5. Башмакова В. Молекулярное клонирование, или Как поместить в клетку чужеродный генетический материал: http://old.elementy.ru/lib/431719 6. ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» от 5.06.1997 (в ред. Федеральных законов от 12.07.2000 N 96-ФЗ, от 30.12.2008 N 313-ФЗ, от 04.10.2010 N 262-ФЗ) 7.  Баранов В.С. Генная терапия -- медицина ХХI века. Соросовский образовательный журнал, №3, 1999. С. 63-68. 8. Соловьёва В.В., Кудряшова Н.В., Ризванов А.А. Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки (трансфекция) с помощью гистонов и других ядерных белков. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; VI(3):29-40. 9. Гоигорян А.С., Шевченко К.Г. Возможные молекулярные механизмы функционирования плазмидных конструкций, содержащих ген VEGF. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; VI(3):24-28. 10. http://old.en.wikipedia.org/wiki/Transfection 11. Свердлов Е.Д. Очерки современной молекулярной генетики. Очерк 5. Трансгеноз и новая молекулярная генетика // Молек. генетика, микробиол., вирусол. - 1996. - №4. - С. 3-32. 12. Свердлов Е.Д. Очерки современной молекулярной генетики. Очерк 6. Генная терапия и медицина ХХI века // Молек. генетика, микробиол., вирусол. - 1997. - №2. - С. 3-28. 13. Clackson T. Regulated gene expression systems // Gene Therapy. - 2000. - Vol. 7. - P. 120-125. 14. Hodgson C.P. The Vector Void in Gene Therapy // BioTechnology. 1995. Vol. 13. P. 222-225. 15. Smith K.T., Stepherd A.J., Boyd J.E., Lees J.M. Gene Delivery Systems for Use in Gene Therapy: An Overview of Quality Assurance and Safety Issues // Gene Therapy. 1996. Vol. 3. P. 190-200. 16. Ткачук В.А. Генная и клеточная терапия в современной биологии и медицине. Тезисы, 9.03.2010.