3D биопечать тканей и органов

Шон В. Мёрфи и Энтони Атала

Трехмерная (3D) печать пробивает дорогу ключевым инновациям во многих сферах, таких как инженерное дело, промышленность, искусство, образование и медицина. Последние достижения науки позволили осуществлять 3D-печать биосовместимых материалов, клеток и их  вспомогательных компонентов с дальнейшим созданием на их основе полнофункциональных живых тканей. 3D-биопечать можно использовать в регенеративной медицине для трансплантации необходимых тканей и органов. По сравнению с 3D-печатью из неорганических материалов, в биопечати существуют усложняющие процесс факторы, такие как выбор материалов, типов клеток, факторы их роста и дифференцировки, а также технические сложности, связанные с сенситивностью клеток и формированием тканей. Для решения этих проблем необходимо взаимодействие технологий из сферы инженерии, науки о биоматериалах, клеточной биологии, физики и медицины. Метод 3D-биопечати уже используется для выращивания и трансплантации некоторых тканей, в числе которых многослойный эпителий, кость, сосудистые трансплантаты, трахеальные шины, ткани сердца и хрящевые структуры. Другие области применения трехмерной биопечати включают моделирование тканей с высокими фармакодинамическими показателями в исследовательских целях, а также для разработки новых лекарств и токсикологического анализа.

Изобретение ксилографии с последующим внедрением печатного пресса в производственный процесс в промышленности XV века позволило быстрее воспроизводить текстовые и графические данные, а также ускорило распространение информации. Печать совершила революцию в обществе, оказав влияние на политику, религию, образование и язык во всем мире. В последние десятилетия технологии печати шагнули далеко вперед - от двухмерной печати до аддитивного процесса, в котором последовательным наложением слоев формируются трехмерные объекты. Создание 3D объектов сложной геометрической формы применяется как для быстрого создания макетов и производства продукции, так и для производства  потребительских товаров, таких как велосипедные детали, украшения или электрические компоненты -  буквально в домашних условиях. Помимо использования в производстве и потребительском секторе, 3D печать дает новые возможности для науки и образования. Например, археологи и антропологи могут создать копии редких артефактов или ископаемых, которые можно брать в руки, свободно делиться ими и распространять. Подобно тому, как Уотсон и Крик смоделировали структуру ДНК из шариков и палочек, в наши дни 3D-печать используется для моделирования сложных молекул, создания моделей взаимодействия белковых соединений, а также для изготовления лабораторных инструментов под заказ.

3D-печать дает студентам доступную возможность проектировать, визуализировать, облекать в физическую форму свои идеи и тестировать их в реальных условиях. Метод 3D-печати был впервые описан в 1986 году Чарльзом В. Халлом. По его методу, названному «стереолитографией», тонкие слои материала, затвердевая под действием ультрафиолетовых лучей, последовательно формируют слои твердой трехмерной структуры. Позднее этот метод стал использоваться для создания композитных форм для культивирования клеток на трехмерных подложках-носителях, так называемых «скаффлодов», из биологических материалов. Развитие систем на водной основе, не содержащих растворителей, сделало возможным напрямую печатать скаффолды из биоматериалов для использовании их в трансплантации, с подобранными клетками или без них. Следующей ступенью была 3D биопечать как метод инженерии тканей, что стало возможным благодаря последним достижениям в технологиях трехмерной печати, клеточной биологии и материаловедения. Другой родственной сферой применения 3D печати стало производство медицинских приборов, таких как стенты и шины для клинического использования. В 3D-биопечати для формирования трехмерных структур применяется аддитивное наращивание биологических материалов, биохимикатов и живых клеток послойно с контролем размещения функциональных компонентов в пространстве. Существует несколько подходов к 3D биопечати, в том числе биомимикрия, автономная самосборка и наращивание из тканевых «кирпичиков»

Исследователи развивают эти подходы с целью создать трехмерные функционирущие в человеческом организме конструкции, которые будут обладать биологическими и механическими свойствами, необходимыми для заживления ткани и функционирования органа. Одной из наиболее важных проблем является необходимость приспособления технологий, созданных для печати расплавленного пластика и метала, к печати чувствительных, живых биологических материалов. В то же время необходима работа над решением вопроса о репродукции сложной микроархитектуры  компонентов ВКМ (внеклеточного матрикса) и многочисленных типов клеток в достаточном количестве для выполнения биологических функций.

В этой статье мы рассмотрим применение 3D-печати в тканевой и органной инженерии. Первым шагом раскрытия данного вопроса будет рассмотрение основных стратегий печати тканевых конструкций. Далее мы опишем различные типы биопринтеров и их влияние на готовые печатные тканевые конструкции. И, наконец, обсудим пошаговый процесс печати ткани, технологические ограничения на данном этапе развития науки и проблемы, которые необходимо решить в ходе будущих исследований.

Подходы к 3D биопечати

Трехмерная биопечать основывается на трех основных подходах: биомимикрии, автономной самосборке и построении тканевых мини-блоков. Рассмотрим каждую из этих стратегий более детально.

Биомимикрия

Инженеры уже давно обращаются к природе в ходе решения серьезных технических проблем, как, например, при конструировании воздушного транспорта, выборе материалов, клеточном культивировании и нанотехнологии. Такой подход к 3D-биопечати подразумевает изготовление идентичных копий клеточных и внеклеточных компонентов ткани или органа. Этого можно достичь путем создания определённых клеточных компонентов ткани или биоматериалов, физиологически соответствующих данной ткани. Для того, чтобы достичь результатов при использовании данного метода, необходима репликация биологических тканей уже на микроскопическом уровне. По этой причине важно точное понимание строения и функционирования микросреды (включая специфическое микроокружение основных и поддеживающих клеток), градиентов растворимых и нерастворимых факторов, строения внеклеточного матрикса, природы биологических явлений, которые возникают внутри клетки. Получение новых данных в этой сфере обусловливает необходимость различных исследований в области инженерии, биоматериалов, клеточной биологии, биофизики и медицины, что нужно для получения продуктивных результатов при использовании данного подхода.

Автономная самосборка

Еще одним подходом к воспроизведению биологических тканей является использование стратегии развития органов в эмбриогенезе как базовой основы. Так, ранние клеточные компоненты развивающейся ткани производят свои собственные элементы внеклеточного матрикса, приобретают сигнальные системы, организацию и характеристики, обусловливающие желаемую микроархитектуру и функции. «Бескаркасный» вариант этого подхода включает использование самособирающихся клеточных сфероидов, которые будут подвергаться расплавлению и клеточной реорганизации для воссоздания развивающихся тканей. Принцип автономной самосборки основывается на том утверждении, что клетка как основной стимулирующий фактор гистогенеза управляет структурной организацией, локализацией и основными свойствами ткани. Применение этого подхода требует глубоких знаний механизмов развития тканей в эмбриогенезе, а также разработки методов управления микроокружением ткани для регулирования механизмов клеточной дифференцировки в готовой печатной модели.

Мини-ткани

Концепция мини-тканей уместна для обеих вышеупомянутых стратегих трехмерной биопечати. Органы и ткани будут состоять из небольших функционирующих блоков, так называемых «мини-тканей» - наименьших структурных и функциональных компонентов ткани. Мини-ткани могут быть объединены в конструкции большего размера как оптимальным предварительным размещением, так и без стороннего вмешательства. Не исключается и комбинация этих методов. Таким образом, существуют две основные стратегии. Первая – самособирающиеся клеточные сфероиды, которые будут объединены в ткани с помощью физиологичного размещения. Вторая – полученные тканевые единицы будут сами собираться в функционирующую ткань без каких-либо вмешательств извне. Практическим примером применения данных методов может быть самосборка сосудистых блоков при формировании ветвящегося васкулярного дерева, и биопечать функциональных тканевых блоков, которые образуют «кристальный орган», укрепляющийся микрожидкостными сетями и используемый для изучения влияния наркотиков и вакцин или как модель для изучения болезней in vitro.

Скорее всего, для печати мультифункциональной комплексной трехмерной структуры будет необходимо комбинировать вышеупомянутые стратегии. Главные этапы печати, общие для всех методов, таковы: создание образа и оформление, проектирование, выбор материалов и клеток, печать тканевой конструкции (Рис.1). Далее печатная конструкция трансплантируется (иногда после созревания in vitro) или подвергается анализу в лабораторных условиях.

Визуализация и цифровой дизайн

Необходимым требованием к репродукции гетерогенной структуры функциональной ткани или органа является исчерпывающее понимание структуры и организации их компонентов. Медицинские технологии визуализации - это незаменимый инструмент тканевых инженеров, используемый для обеспечения сохранения информации трехмерной структуры и функционирования клеточного, тканевого, органного и организменного уровней жизни. Эти технологии включают в себя большинство неинвазивных методов визуализации, самыми распространенными из которых являются КТ (компьютерная томография) и МРТ (магнитно-резонансная томография). Инструменты компьютерного моделирования и автоматического производства (CAD-CAM), а также математическое моделирование используют, чтобы собирать и оцифровывать комплекс томографической и структурной информации о ткани.

Моделирование с помощью компьютерной томографии используют как для диагностики, так и для интервенционных процедур, которые базируются на разнице в поглощении рентгеновских лучей теми или иными тканями. Источник излучения вращают вокруг объекта, и пучок рентген лучей проходит сквозь тело, а тем временем сенсоры измеряют интенсивность выпущенного пучка и угол его отклонения и записывают информацию о комбинации пикселей, которые представляют небольшую часть (воксел - элемент объёмного изображения) ткани. Данное модальное изображение воспроизводит плотно расположенные слои (срезы) ткани, так что после рендеринга поверхности и стереолитографического редактирования мы имеем полное объемное изображение ткани.

Второй метод – МРТ, также может обеспечивать высокое пространственное разрешение в мягких тканях, с преимущественно повышенным контрастным разрешением, что является безусловно полезным для моделирования мягких тканей в непосредственной близости к другим типам тканей без использования ионизирующей радиации. МРТ использует ядерно-магнитный резонанс: сильное магнитное поле заставляет небольшую часть ядер в ткани выстраиваться в линию относительно магнитного поля. Изменения в энергетических состояниях нуклеозидов создает радиочастотные сигналы, которые измеряются приемными катушками. Контраст в биоструктурах может быть значительно повышен при помощи таких контраст-агентов, как барий или йод для КТ, гадолиний или металопротеины для МРТ. Это вещества ослабляют рентген лучи или усиливают магнитно-резонансные сигналы, которые обычно используют для выделения структур, таких как круги кровообращения, которые в противном случае довольно сложно выделить из их окружения.

После того как изображение было получено, данные должны быть обработаны с использованием томографической реконструкции для получения 2D изображения поперечного среза ткани. Анатомические 3D модели могут быть получены и использованы для дальнейшего анализа или модификации. Этот процесс можно назвать преобразованием "аналитической анатомии" в «синтетическую анатомию». Один из способов создания компьютерных 3D-модели структуры органов или тканей подразумевает использование инструментов компьютерного моделирования и автоматического производства, а также математического моделирования. Трёхмерные анатомические изображения дают наглядное представление об облике органа в нескольких проекциях, сохраняя воксельную информацию, которую можно применить для формирования объёмного изображения.  Восстановленные изображения или модели можно рассматривать несколькими способами, в том числе в виде контурных стеков, в качестве каркасных моделей, затененных моделей или твердотельных моделей с различным освещением, прозрачностью и отражательной способностью. Если целью является точное отображение органа или ткани, то двухмерное сечение или 3D-модель могут быть использованы непосредственно для биопечати. Кроме того, точная копия собственного органа пациента может быть нежелательной вследствие болезни или ранения или экономически нецелесообразной для крупномасштабного производства. В этой ситуации компьютерные модели могут полностью или частично способствовать анатомическому структурному проектированию, анализу и моделированию. Кроме того, компьютерное моделирование может помочь в прогнозировании механических и биохимических свойств готовых биоконструкций.

Законченная виртуальная модель органа или ткани обрабатывается цифровыми автоматическими системами печати для прототипирования и серийного выпуска. Это достигается преобразованием двухмерной вёрстки в трёхмерную таким образом, что трёхмерная модель делится на тонкие двухмерные слои (чьи толщина и положение в пространстве настраиваемы), которые импортируются в буферное запоминающее устройство биопринтера. Анатомическая и струкктурная информация, содержащаяся в двухмерных моделях слоёв, снабжает биопринтер инструкциями по послойному расположению биоматериала. Различные технологии трёхмерной печати по-разному подходят к формированию тканей и органов. В одних случаях системы трёхмерной печати располагают на основу по маленькой порции материала, чтобы крупицей за крупицей собрать в объёме требуемый орган или ткань. Другие трёхмерные принтеры укладывают относительно большие объёмы материала сразу на протяжении определённого периода. При поиске подхода к формированию ткани необходимо учитывать возможности и особенности биопринтеров, о чём будет рассказано ниже.

Стратегии биопечати тканей

Главные технологии, которые используются для расположения и размещения биологического материала – это струйная, микроэкструзионная и лазерная печать. Различные свойства, характерные для этих технологий, должны быть учтены в соответствии с важнейшими факторами трёхмерной биопечати – поверхностное разрешение, выживаемость клеток в составе материалов и собственно биологические материалы, задействованные в печати.

Струйная биопечать

Струйные принтеры – это наиболее распространённый тип принтеров, используемыхх в печати в целом и в биопечати в частности. Задаваемые программой количества жидкости подаются  на определённые области. Первые принтеры, использовавшиеся для биопечати, представляли собой модифицированные версии обычных двухмерных струйных принтеров, запрвляемых тонером. Тонер в картриджах заменяли биологическим материалом, а бумагу – управляемым электроникой поддоном, контролировавшим положением печатающей головки в оси z. В настоящий момент струйные биопринтеры специально приспособлены правильно хранить и распределять биологические материалы в большем разрешении, точнее и быстрее. Струйные принтеры используют акустические или термальные процессы для выброса капель жидкости (в случае двухмерного принтера – красителя) на субстрат (напр. бумага, уже отпечатанный материал или специальный поддон), который поддерживает и формирует конструкцию конечного продукта.

Термальные струйные принтеры действуют так. Микроскопический нагревательный элемент в сопле при прохождении электрического тока мгновенно нагревается и образует в жидкости газовые пузырьки, которые вытесняют жидкость из сопла. Несколько исследований показали, что это строго локализованное нагревание, достигающее двухсот-трёхсот градусов, не оказывает критического влияния на стабильности биологических молекул вроде дезоксирибонуклеиновой кислоты или на выживаемости или функциональной эффективности живых клеток после печати. В Ходе этих исследований стало ясно, что короткое, в две микросекунды, нагревание приводит к повышению температуры в печатающей головке лишь на четыре-десять градусов. К преимуществам термальной струйной печати относят высокую скорость печати, низкую стоимость и широкую доступность. Как бы то ни было, угроза экспозиции клеток и тканей грубому тепловому и механическому влздействию, относительно низкая точность выброса капель, их неравномерное распределение в калибрах, частая закупорка сопла и ненадёжная изоляция клеток дают понять о негативных сторонах этого способа печати.

Во многих струйных принтерах используется пьезоэлектрический кристалл, который создает звуковую волну внутри головки принтера для распыления жидкости на мелкие капли с определенной частотой. Под напряжением, пьезоэлектрический кристалл мгновенно меняет форму, создавая давление, необходимое для выбрасывания капель из сопла. Другие струйные принтеры используют звуковое излучение, создаваемое ультразвуковой волной для выброса капель из воздушно-жидкостной системы. Параметры ультразвука, такие как частота, продолжительность и амплитуда, могут быть отрегулированы для контроля размера капель и частоты выброса. Преимущества акустических струйных принтеров включают в себя возможность создания и соблюдения одинакового размера капель и выбрасывать их, предотвращая воздействие на клетки тепла и давления. Кроме того, избежать вертикального давления, оказываемого на клетку в сопле, позволяет оупен-пулл система, лишенная сопла. Это уменьшает вероятность снижения жизнеспособности и функциональности клетки и позволяет избежать проблемы закупорки сопла. Звуковые экстракторы могут быть сформированы в регулируемый блок из нескольких экстракторов, что облегчает постоянную печать разными типами клеток и тканей. Но даже в этом случае остается трудность, связанная с 15–25Кгц частотами, используемыми пьезоэлектрическими струйными биопринтерами, и их способностью вызывать повреждения мембран и лизис клеток. Струйные биопринтеры также имеют некоторые ограничения по вязкости материалов (в идеале ниже 10), связанные с силой, требуемой для экстракции капель растворов высокой вязкости.

Еще один распространенный недостаток струйных биопринтеров заключается в том, что биологические материалы должны находиться в жидкой форме для образования капелек. Таким образом, перенесенная на бумагу жидкость затем должна сформировать 3D объект со структурной организацией и функциональностью. Наша команда и сторонние исследователи показали, что это ограничение может быть преодолено при использовании материалов, которые могут сшиваться между собой, после наложения, под воздействием химических факторов, кислотности или ультрафиолета. Однако факторы для сшивания обычно замедляют процесс биопечати и вовлекают химические модификации экстрацеллюлярного матрикса структуры, что изменяет его как химические, так и физические функции. К тому же, некоторые механизмы сшивания требуют присутствия токсических веществ или условий, опасных для клетки. Пользователи струйных биопринтеров столкнулись с еще одной проблемой - сложность достижения необходимой биологической плотности клеток. Обычно, низкие концентрации клеток (меньше 10 млн./мл) используются для облегчения образования капелек и для предотвращения закупорки сопла. Более высокие концентрации клеток могут также замедлять некоторые механизмы сшивания гидрогеля.

Несмотря на это, недостатки струйных биопринтеров перекрываются преимуществами, включающими низкую стоимость, высокую разрешающую способность, высокую скорость печати и совместимость со многими биологическим материалами. Еще одним преимуществом струйных биопринтеров является способность создавать градиент концентрации клеток, тканей или факторов роста по всей площади 3D структуры, посредством изменения размеров и плотности капель. По причине доступности обычных 2D струйных принтеров, исследователи во множестве лабораторий могут запросто их получить, модифицировать и экспериментировать с 3D биопечатью. Коммерчески доступные струйные биопринтеры также относительно эффективны в соотношении цена/качество, благодаря своему простому устройству и доступному программному обеспечению. Широкое применение этой технологии среди многих групп исследователей способствует увеличению емкости струйных биопринтеров, точности наложения, большей разрешающей способности и точности настройки размера капель с постоянной клеточной плотностью. Размер капель и частота выброса контролируются электроникой: объём капель достигает от одного до трёхсот пиколитров, частота принимает значения в пределах от одной до десяти тысяч капель в секунду. На выходе получаются линейные структуры шириной 50 микрометров из капель, каждая из которых содержит по одной-две клетки. Будущие усовершенствования продолжат адаптировать эту технологию для наложения других материалов в целях облегчения, как печати, так и обеспечения необходимыми структурными и функциональными компонентами тканей. Другие трудности, такие как необходимость использования нескольких типов клеток и материалов, будут также разрешены.

Отдельные образцы струйной биопечати подходят для регенерации полноценных кожных покровов и хрящей in situ. Высокая скорость печати дает возможность непосредственного наложения клеток и материалов на кожу или поврежденный хрящ. При этом подходе достигается мгновенное сшивание содержащего клетки материала путем биосовместимых химических реакций или фотоинициации и сшивания посредством экспозиции материала в УФ-лучах. Струйный метод облегчает наложение как главных клеток, так и стволовых с однородной плотностью по всему объему поражений и поддерживающий высокий уровень жизнеспособности клеток после печати. Эти исследования демонстрируют возможности применения струйной биопечати для восстановления функциональных систем.

Волокнистый хрящ уже был изготовлен in vitro при использовании комбинированного метода электроспиннинга и струйной биопечати. Гибрид электроспиннинг-струйная биопечать, воплотил производство слоистых объектов, которые способны поддерживать клеточные функции и сохранять соответствующие механические и структурные свойства. Струйные биопринтеры также использовались для создания костных фрагментов, выращиваемых in vitro перед пересадкой в мышь. Эти объекты продолжили расти in vivo и сформировались в высокоминерализированную ткань с плотностью, схожей с обычной костной тканью.

Микроэкструзионная биопечать

Наиболее распространенные и доступные небиологические 3D-принтеры используют микроэкструзию. Микроэкструзионные биопринтеры обычно состоят из нагревательного элемента, системы подачи, одного или двух предметных столиков, способных двигаться по осям x, y и z, оптоволоконного источника света для освещения области печати и/или для фотоактивации, видеокамеры для x-y-z команд и контроля, а также пьезоэлектрического увлажнителя. Немногие системы используют несколько печатных головок для ускорения серийной печати нескольких заготовок. Около 30 000 3D принтеров продается по всему миру за год, и университеты активно покупают и применяют технологию микроэкструзии к исследованиям в области тканевой и органной инженерии. Промышленные принтеры значительно более дороги, но имеют большую разрешающую способность, скорость печати и больший спектр материалов, используемых для печати.

Микроэкструзионные принтеры работают на автоматизированной экструзии материала, которая накладывается на основание при помощи головки-экструдера. Маленькие шарики материала располагаются в двух измерениях; согласно установке CAD-CAM программ, столики или головка микроэкструзора движется по оси z и отлитый слой служит основанием для следующего слоя. Множество материалов совместимы с микроэкструдорами, включая гидрогели, биосовместимые полимеры и клетки-сфероиды. Наиболее распространенным методом для экструзии биологического материала для 3D биопечати являются пневматические или механические системы подачи. Механическая система подачи дает более точный контроль над потоком материала, так как в пневматических системах присутствует задержка выхода сжатого газа. Пневматические принтеры имеют преимущество в простоте системы подачи материала, и их мощность ограничена лишь силой давлений воздуха в системе. Механические системы содержат сложные механизмы небольших размеров, позволяющие оказывать точный пространственный контроль, но в ущерб максимальной мощности.

Метод микроэкструзии технически совместим с широким спектром жидкостей, в том числе со многими биосовместимыми материалами, описанными в литературе. Доказано, что материалы с вязкостью в пределах от 30 mPa/s до 6x107 mPa/s совместимы с микроэкструзионными бипопринтерами; материалы более высокой вязкости создают структурную опору для напечатанного объекта, а материалов с более низкой вязкостью создают подходящие условия для поддержания жизнеспособности и функционирования клеток. Для микроэкструзионной биопечати исследователи часто используют материалы, которые могут сплавляться и/или самоистончаться. Некоторые биосовместимые материалы обладают текучестью при комнатной температуре, что позволяет экструдировать их вместе с другими биосовместимыми компонентами, но сшиваться в стабильный материал при температуре тела. Материалы, обладающие текучестью при физиологических температурах тела (35–40 C), но сшивающиеся при комнатной температуре, могут быть также использованы для задач биопечати. Материалы со свойством самоистончения обычно используются для задач микроэкструзии. Неньютоновские свойства этих материалов вызывают уменьшения вязкости с целью увеличения скорости прохождения. Высокая скорость прохождения, присутствующая в сопле во время изготовления, позволяет материалам течь через сопло, но наложении скорость уменьшается, что вызывает резкое увеличение вязкости. Высокое разрешение систем микроэкструзии позволяет биопринтерам точно изготавливать сложные объекты, используя CAD программы и облегчать моделирования многочисленных типов клеток.

Главным преимуществом технологии микроэкструзионной биопечати является возможность наложения клеток с очень высокой плотностью. Достижение физиологической плотности клеток в (ткане)инженерных органах - основная задача в области биопечати. Некоторые группы исследователей использовали для микроэкструзионной биопечати 3D тканей растворы, состоящие исключительно из клеток. Сфероиды из клеток накладывались и самоорганизовывались в искомую 3D структуру. Считалось, что тканевые сфероиды обладают свойствами имитировать физические и функциональные свойства тканевого экстрацеллюлярного матрикса. В зависимости от вязкости и эластичности печатаемых объектов, группы клеток сплавляются друг с другом, формируя плотный макро-структуру. Одно преимущество технологии самоогранизующихся сфероидов - это возможность ускорения организации ткани и возможность непосредственного формирования сложных объектов. Такой подход в будущем позволит создавать внутриорганные разветвленные системы сосудов в толстых слоях ткани или органов, построенных путем моделирования из самоорганизующихся клеток-сфероидов ткани сосудов. Самая популярная технология биопечати без использования каркасов - механическая микроэкструзия.

Жизнеспособность клеток после микроэкструзионной биопечати ниже, чем при струйной биопечати; частота выживания клетки находится в пределах 40–86% и уменьшается с увеличением давления экструдора и калибра сопла. Уменьшение жизнеспособности клеток, нанесенных при помощи микроэкструзии, вероятнее всего результат стресса, причиняемого клеткам движением вязких жидкостей. Возможно, что давление в системе подачи может оказывать более существенное влияние на жизнеспособность клеток, чем диаметр сопла. Хотя жизнеспособность клеток может поддерживаться при помощи низких давлений и применения сопел широких размеров, недостатком может стать сильная потеря в разрешающей способности и скорости печати. Поддержание высокого уровня жизнеспособности клеток необходимо для достижения функциональности тканей. Не смотря на то, что многие исследования сообщают о сохранении жизнеспособности клеток после печати, авторам необходимо продемонстрировать, что эти клетки не только выжили, но и выполняют свои естественные функции в ткани.

Увеличение разрешающей способности принтеров и скорости - это вызов для многих исследователей технологии микроэкструзионной биопечати. Небиологические микроэкструзоры способны печатать с разрешением 5–200 мкм на скорости в 10–50 мкм/с. Предстоит увидеть, достижимы ли эти параметров при сохранении жизнеспособности клеток и их функционала. Использование улучшенных биосовместимых материалов, таких как гидрогели, которые крепко связываются во время печати и приобретают вторичные изменения после, могут помочь сохранять жизнеспособность клеток после печати. Также, усовершенствования сопла, пневматических или моторизированных систем могут уменьшить время печати, а так же позволить наносить разнообразные материалы одновременно.

Микроэкструзионные биопринтеры использовались для создания многих типов тканей, включая клапаны аорты, разветвленные сосудистые системы и модели фармокинетики in vitro, а также модели опухолей. Хотя на изготовление сложных объектов в высоком разрешении может уходить много времени, технология позволяет создавать ткани с размерами от используемых в клинике до микро-тканей в микрожидкостных камерах.

Лазер-опосредованная биопечать

Лазер-опосредованная биопечать (Laser-assisted bioprinting , LAB), основана на принципах прямого  лазер-индуцированного переноса (97,98).

Изначально разработанная  для переноса металлов,  технология прямого лазер-индуцированного переноса была успешно применена  для биологического материала: пептиды, ДНК и клетки (99-102). Хотя реже, чем струйная  или микроэкструзионная биопечать, LAB всё чаще используется для ткане-  и органно-инженерных приложений. Типичное LAB-устройство состоит из импульсного лазерного луча, фокусирующей системы, "ленты", имеющей донор транспортного обеспечения, как правило, из стекла, покрытого лазер-поглощающим слоем (например, золото или титан) и слоем биологического материала (например, клетками и / или гидрогелем), приготовленного  в виде жидкого раствора, и принимающего субстрата перед лентой. LAB функционирует с помощью сфокусированных лазерных импульсов на поглощающем слое ленты для создания пузыря высокого давления, который продвигает вперед  вещества, содержащие клетки,  по направлению к подложке коллектора.

Разрешение LAB зависит от многих факторов, в том числе от: плотности потока  лазера (энергии , приходящейся на единицу площади), поверхностного натяжения,  смачиваемости подложки, воздушного зазора между лентой и субстратом, а также от толщины и вязкости биологического слоя(103).  Поскольку при LAB не используется насадка-сопло, удается избежать проблемы засорения клетками или материалами, которые мешают при других технологиях биопечати.  LAB совместим с жидкостями различной вязкости (1-300 мПа /с) и может печатать клетки млекопитающих с незначительным воздействием на жизнеспособность и функциональность клеток (104-106). LAB может размещать  клетки с плотностью до 108 кл / мл с разрешением микрошкалы 1 клетка на каплю  с помощью лазера с частотой импульсов  5 кГц, со скоростью до 1600 мм / с (ссылка 49).

Несмотря на эти преимущества,  высокое разрешение  LAB требует  быстрой  кинетики гелеобразования для достижения высокого качества формы, что приводит к относительно низкой скорости потока в целом(107 ).  Приготовление каждой индивидуальной  ленты, которая часто требуется для каждого из печатаемых типов  клеток или гидрогеля, отнимает много времени и  это может стать обременительным, если несколько  типов клеток и / или материалов  должны быть  расположены  вместе. Из-за  характера клеточного покрытия   ленты может быть трудно точно направить  клетки и  задать их позицию. Некоторые из этих проблем можно преодолеть, используя технологию распознающего  клетки сканирования для того, чтобы лазерный луч  выбирал  одну клетку за  импульс. Эта так называемая «aim-and-shoot»-процедура может гарантировать, что каждая  печатаемая  капля  будет содержать заданное число клеток. Тем не менее, статичная  клеточная печать может быть достигнута с использованием  ленты с очень высокой концентрацией клеток, устраняя  тем самым необходимость в такой специфической их ориентации (49). Наконец,  в конечной биопечатной  конструкции присутствуют  металлические остатки вследствие испарения металлического лазеропоглощающего  слоя во время печати. Избежать этого загрязнения можно при  использовании неметаллических поглощающих слоев и модификации процесса печати в не требующий  поглощающего слоя (108,109). Высокая стоимость этих систем является также проблемой для основных исследований тканевой инженерии, хотя, как это бывает с большинством 3D технологий печати, эта стоимость быстро снижается прямо пропорционально развитию технологий.

Применение LAB для изготовления конструкции кожи клеточного строения продемонстрировало потенциал для печати  с клинически значимой плотностью клеток в построении  ткани из нескольких слоев, но неясно,  может ли эта система  быть расширена до ткани больших размеров. (110).

In vivo LAB была использована для нанесения нано-гидроксиапатита на свод черепа мыши ( 3D модель повреждения)( 111).

В этих исследованиях отверстие  в своде  черепа,  диаметром  3 мм, 600 мкм глубиной,  было заполнено гидроксиапатитом для подтверждения идеи.  Лазерная 3D-печать была использована для изготовления медицинских устройств, таких как индивидуальные, неклеточные, биоразлагаемые шины трахеи, которые могут быть имплантированы  пациентам детского возраста  с локализованной трахеобронхомаляцией  (11).  В будущем в исследованиях возможно использование материалов, которые можно будет непосредственно интегрировать  в ткани пациента. Кроме того, включение собственных клеток пациента может облегчать применение этих типов конструкций, внося свой вклад как в  структурные, так и в функциональные компоненты тканей.

Вставка 1 Идеальные свойства материала для биопечати.

Выбор соответствующих материалов для использования в  биопечати и их эффективность в конкретном случае зависит от нескольких особенностей. Они перечислены ниже.

• Пригодность для печати

Свойства, которые облегчают обработку и осаждение со стороны биопринтера могут включать вязкость, методы гелеобразования и реологические свойства.

• Биологическая совместимость

Материалы не должны вызывать нежелательные местные или системные реакции со стороны реципиента  и должны активно и контролируемо влиять на  биологические и функциональные компоненты  конструкции.

• Кинетика распада и его продукты

Скорость разложения должна соответствовать  способности  клеток производить свой собственный межклеточный матрикс;  продукты распада должны быть нетоксичными;  материалы должны продемонстрировать подходящие характеристики набухания или  сокращения в объеме.

• Структурные и механические свойства

Материалы должны быть выбраны на основе требуемых механических свойств конструкции, начиная от жестких термопластичных полимерных волокон для прочности до мягких гидрогелей для клеточной совместимости.

• Биомимикрия материалов

Инженерия желаемых структурных, функциональных и динамических свойств материалов должна быть основана на данных об эндогенных материалах, специфичных для отдельно взятой ткани.

Материалы и каркасы (скаффолды)

Первоначально технологии 3D печати были разработаны для небиологического применения, такого как осаждение металлов, керамики и термопластичных полимеров, и обычно включали  использование органических растворителей, высоких температур или связывающих  агентов, которые не совместимы с живыми клетками и биологическими материалами. Таким образом, одной из основных проблем в области 3D биопечати был поиск  материалов, которые не только совместимы  с биологических материалами и процессом  печати, но и могут  обеспечить требуемые механические и функциональные свойства  тканевых конструкций.

Материалы, используемые в настоящее время в медицине для восстановления и регенерации, преимущественно создаются либо на основе материалов природного происхождения (в том числе полимеров альгината, желатина, коллагена, хитозана, фибрина и гиалуроновой кислоты, часто выделенного из животных тканей), либо из синтетических молекул (полиэтиленгликоля ; PEG112-115). Преимуществом природных полимеров для 3D биопечати  и других приложений для тканевой инженерии являются их сходство с человеческим межклеточным матриксом  и свойственная им биологическая активность. Преимуществом  синтетических полимеров является то, что они могут быть адаптированы по специфическими физическими свойствами в соответствии с конкретными приложениями. Проблемы при  использовании синтетических полимеров включают плохую биосовместимость, токсичные продукты распада и потерю механических свойств  при распаде. Тем не менее, синтетические гидрогели, которые являются гидрофильными и абсорбирующими,  подходят  для 3D биопечати, используемой в интересах регенеративной медицины, благодаря легкости контроля за их физическими свойствами в процессе синтеза. Так как разнообразие биологических материалов для медицинских приложений увеличивается, список желательных черт для печатных материалов становится  более конкретным и сложным (Вставка 1).

Материалы должны иметь соответствующие механизмы соединения для содействия осаждению биопринтером,  должны быть биологически совместимы  для долгосрочной трансплантации и иметь соответствующие характеристики набухания и краткосрочной стабильности. Краткосрочная стабильность необходима для поддержания первоначальных механических свойств, исключая коллапс  тканевых структур, таких как поры, каналы и сети. Так как напечатанные с помощью 3D-технологий  ткани развиваются in vivo, они должны быть  доступны ремоделированию, облегчая формирование структур, управляемых клеточными и физиологическими  потребностями. Самое главное, материалы должны поддерживать пролиферацию, клеточную адгезию  и функционирование клеток (64). Теперь  более подробно  обсудим ключевые атрибуты пригодности к печати, биосовместимость, кинетики и побочных продуктов распада, структурных и механических свойств, и материальной биомимикрии.

Пригодность для печати

Важным свойством материала для биопечати является возможность его точного размещения при временном и пространственном контроле процесса. Некоторые типы биопечатных технологий, как, например, струйный принцип, требуют определенных ограничений в вязкости материала, в то время как другие подходы, например, экструзионный, нуждается в материалах с особыми сшивающими или псевдопластичными свойствами. Кроме того, необходимым является определение основных технологических параметров, как, например, напряжения сдвига, которому поддаются клетки в процессе биопечати, и времени, необходимого для обретения данным материалом трехмерной структуры с помощью используемого метода. К примеру, для струйной печати необходимы материалы с коротким временем сшивания, способствующие наслаиванию трехмерной модели. В то же время, экструзионный принтер может соединить материалы высокой вязкости, которые будут поддерживать трехмерную форму после размещения модели, с дальнейшим сшиванием после завершения процесса изготовления.

На выбор материала также может влиять его способность защищать клетки и поддерживать их жизнеспособность в ходе самого процесса печати. И лазерная, и термоструйная печати предусматривают локальное нагревание материала во время изготовления. Вещества, обладающие низкой теплопроводностью или свойством амортизировать клетки в ходе процесса, смогут повысить жизнеспособность клеток и их функциональность в готовой модели.

Несмотря на широко варьирующую жизнеспособность клеток в готовых моделях, что объясняется особенностями используемых принтеров, свойствами материалов, разрешением и клеточным материалом, средние показатели для разных методов являются следующими: для струйной биопечати – свыше 85%, для экструзионной печати – 40-80%, и свыше 90% жизнеспособных клеток при использовании лазерных принтеров.

Биологическая совместимость

С развитием тканевой инженерии цель биосовместимости также сменила акценты: от разработки имплантируемого материала, способного сосуществовать с эндогенными тканями без создания нежелательных локальных или системных эффектов в организме реципиента, до создания материалов, что не только не будут препятствовать нормальному функционированию организма, но и смогут активно влиять на физиологические показатели. Биосовместимость для процесса биопечати означает активный и контролируемый вклад компонентов в функциональность всей конструкции. Это может проявляться во взаимодействии с тканями организма иили иммунной системой, поддержании необходимой клеточной активности и позитивном воздействии на молекулярные или механические сигнальные системы – все это крайне важно для успешной трансплантации и функционирования модели.

Кинетика распада и побочные продукты

В ходе деградации каркас из материалов клетки, что входят в его состав, начинают синтезировать протеазы, а со временем и протеины внеклеточного матрикса, что определяют образование новой ткани. Очень важно, чтобы кинетика распада была контролируема. Некоторые аспекты процесса деградации подлежат особому рассмотрению. Во-первых, необходимо контролировать уровень деградации, в идеале - согласовывать уровень деградации со способностью клеток заменять материалы на синтезируемые ими же протеины внеклеточного матрикса. Этот аспект остается проблемным, поскольку функциональные и механические характеристики материалов, подходящих для определенной ткани, могут не совпадать с уровнем синтеза клеточных компонентов для замещения деградируемых веществ. Побочные продукты процесса деградации также являются важными, потому что довольно часто они определяют уровень биосовместимости каждого конкретного материала. Продукты распада должны быть нетоксичными, легко метаболизироваться и быстро выводиться из организма. Токсичные продукты- это не только протеины и молекулы, а также физиологически недопустимый рН, температура или другие факторы, что могут негативно повлиять на жизнеспособность и функциональность клеток. Например, некоторые полимеры с большой молекулярной массой, которые в целостном состоянии являются инертными, при определенных условиях могут распадаться на олигомеры или мономеры, которые будут распознаваться клетками и могут привести к, например, воспалению или другому нежелательному исходу. Также большое значение имеют показатели набухаемости и сократительные характеристики материалов, используемых в тканевой инженерии. Например, материалы с повышенным уровнем набухаемости потенциально могут привести к абсорбции жидкости из окружающих тканей, а сокращение может стать причиной закрытия пор в сосудах, что сделает миграцию клеток и обмен питательными веществами невозможными.

Таким образом, необходимо понимать возможные последствия при применении многочисленных материалов с различными уровнями набухаемости и сократительными характеристиками, так как одним из наиболее нежелательных результатов может стать потеря целостности слоев или деформация созданной модели.

Структурные и механические свойства

Если материал необходим для поддержания трехмерной структуры (обеспечивая сопротивление или, наоборот, выполняя роль опорной точки при механическом давлении), то необходимым является и поддержание свойств материала, что являются столь важными. Материалы должны выбираться очень осторожно, основываясь на требуемых от печатной модели механических свойствах. В то же время, требования будут разными для различных тканей, начиная от кожи и печени, и заканчивая костной тканью. Одним из подходов к решению этой проблемы является применение абляционных материалов, что обеспечат необходимые структурные и механические свойства в течение необходимого времени. Такие материалы могут использоваться как во время печати (чтобы способствовать необходимому уровню сшивания в модели), так и на готовой модели (путем введения в конструкцию и функционированием до того времени, пока продукты эндогенного синтеза сами не смогут выполнять эту функцию). Учитывая этот подход, необходима разработка материала с особыми структурными и деградационными свойствами при отсутствии токсичных продуктов распада и неиммуногенности.

   Биомимикрия материалов

Важность биомимикрии для биосовместимости начала изучаться относительно недавно. Введение биомиметических компонентов в биопечатные конструкции может позитивно повлиять на соединение, миграцию, пролиферацию и функционирование как эндогенных, так и экзогенных клеток. Давно доказано, что материалы (также, как и размер и форма клеток) оказывают влияние на процессы клеточного соединения, и использование этих принципов может быть полезным для контроля пролиферации и дифференциации клеток в каркасе. Добавление к материалу поверхностных лигандов потенциально также может позитивно повлиять на вышеупомянутые процессы. Наличие на клетках наноразмерных структур, как, например, гребней и борозд, также влияет на процесс соединения клеток, их пролиферацию и сборку компонентов цитоскелета. Трехмерная среда в конструкции, созданной методами тканевой инженерии, может повлиять на форму клеток и их дифференциацию. В то же время, наличие наноразмерных структур может повлиять на клеточную адгезию, ориентацию, подвижность, обнаружение антигенов, конденсацию элементов цитоскелета и модуляцию внутриклеточных сигналов, что регулируют процесс транскрипции и экспрессии генов.

Биомимикрический подход к созданию материалов с особыми физиологическими свойствами требует понимания процесса естественного образования тканеспецифичных соединений и локализации компонентов внеклеточного матрикса в интересующей исследователя ткани. Недавний прогресс в разработке методов децеллюляризации ткани может обеспечить получение неповрежденных каркасов для детального изучения компонентов внеклеточного матрикса, их локализации и функций. Суть процесса состоит в лизисе и изъятии клеточных компонентов ткани, обычно с применением деионизированной воды или мягких ПАР, которые не влияют на тканеспецифичный внеклеточный матрикс. Воспроизведение идентичных каркасов ВКМ, используя методы биопечати, было бы полезным как для тканевой инженерии, так и для регенеративной медицины. Одной из проблем тканевой децеллюляризации является тонкость грани между полным изъятием клеточных компонентов и сохранением кровоснабжения и других структур. К тому же, в ходе роста клеток на децеллюляризованных тканевых каркасах, были обнаружены некоторые токсичные вещества, что можно объяснить связыванием их во внеклеточном матриксе. В млекопитающих выявлено больше 300 протеинов внеклеточного матрикса, многочисленные ВКМ-модифицирующие ферменты, ВКМ-связанные факторы роста и другие белки, что влияют на их активность. В наибольшем количестве присутствуют коллаген, протеогликаны и гликопротеины. Эти протеины обеспечивают силу и функцию выполнения пространства, связывают факторы роста, регулируют белковые комплексы, влияют на клеточную адгезию, принимают участие в сигнальных реакциях, и в некоторых случаях могут иметь дополнительные функции.

Еще одним интересным подходом к биомимикрии материалов может быть «бескаркасный» метод биопечати. Поскольку клетки синтезируют и накапливают внеклеточный матрикс ткани, биопечатные самособираемые клеточные сфероиды также могут синтезировать ВКМ, подходящий для оптимального выполнения их функций. Создание материалов с таким механизмом обеспечит дальнейших контроль над поведением клеток.

Таким образом, основной проблемой является разработка методов введения таких материалов в биопечатные конструкции. При этом необходимо быть уверенным в том, что материалы обладают подходящими временными рамками деградации с нетоксичными побочными продуктами. Функционирование и биологическое влияние таких материалов на конструкцию должно быть детально изучено и контролируемо.

   Источники клеток

Выбор клеток для 3D-биопечати тканей или органов  - важнейшее условие их правильного функционирования в созданном материале. В организме ткани и органы состоят из многочисленных типов клеток с особыми и необходимыми биологическими свойствами, что должны быть воспроизведены и в трансплантируемой ткани. К тому же, кроме основного функционирующего типа клеток, каждая ткань содержит клетки, обеспечивающие опорную, структурную и барьерную функции, которые необходимы для васкуляризации или содают оптимальную микросреду для дифференциации стволовых клеток. Вариантов для биопечати клеток всего два: изначальное внесение шаблонных клеток разных типов как основы будущей ткани или печать стволовых клеток с их дальнейшей пролиферацией и дифференциацией в нужные клеточные типы. Клетки, выбранные для биопечати, должны максимально воспроизводить естественное физиологическое состояние клеток in vivo и сохранять свои свойства в оптимальных условиях.

Любые клетки, что выбираются для биопечати, должны обладать свойством увеличиваться в достаточном количестве. Тщательный контроль клеточной пролиферации in vitro и in vivo крайне важен для биопечати. Слишком низкий уровень пролиферации может стать причиной потери жизнеспособности трансплантируемого материала, в то время как излишняя пролиферация повлечет за собой гиперплазию или апоптоз.

Необходимым также является контроль над клеточной пролиферацией в трансплантированной модели с целью достичь физиологических соотношений функционирующих и выполняющих дополнительные функции клеток. Вдобавок большую роль играет время клеточного деления и методы управления им. Вначале высокий уровень клеточной пролиферации будет желаемым, ведь это необходимо для заполнения созданной модели. Но со временем уровень клеточного деления должен удерживаться на уровне, необходимом для обеспечения клеточного гомеостаза и избежания гиперплазии. Подходы в решении этой проблемы включают вирусную трансфекцию или использование малых молекул, что будут стимулировать пролиферацию и предупредят старение. In vivo роль эндогенных стволовых клеток состоит в замене высокодифференцированных клеток в ходе их естественного процесса регенерации или вследствие травм. Для модели, изготовленной с помощью 3D-биопечати и ее длительного функционирования поддержание клеточного гомеостаза, самообновление и адекватное реагирование на повреждения или травмы также являются важными. Изучение вопроса природы  и функционирования эндогенных стволовых клеток и их микросреды в будущем поможет создать ткани, которые смогут выполнять свои функции в течение длительного времени после трансплантации.

Как и с любыми трансплантированными тканями или органами, потенциальной проблемой при использовании биопечатных моделей может быть отторжение материала иммунной системой организма хозяина. Впрочем, данная проблема может быть решена использованием аутологичного источника клеток или же применением стратегий индукции толерантности. Аутологичные источники клеток могут быть получены с помощью биопсии, путем дифференциации собственных клеток организма или же используя другие подходы. В то же время, если пациент уже болен или имеет генетические, или метаболические заболевания, что не позволяет проводить инвазивные хирургические вмешательства, техника неприменима. К тому же, изолированные клетки могут не выполнять желаемые функции внутри биопечатной модели.

Многие типы первичных клеток тяжело изолировать и культивировать, и их ограниченная продолжительность жизни является одним из лимитирующих факторов для длительного функционирования любой биопечатной модели. Стволовые клетки – многообещающая основа для выращивания органов благодаря их возможности пролиферировать в недифференцированном состоянии (самообновление) и давать начало множественными тканеспецифичным клеточным фенотипам.

Эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки обладают свойством неограниченного самообновления, демонстрируя в исследованиях способность оставаться в недифференцированном состоянии в течение 80 поколений. Возможность плюрипотентных стволовых клеток образовывать большое количество дочерних клеток показывает потенциал данного клеточного типа для использования в биопечати и других терапевтических процедурах. Дальнейшая работа по изучению безопасности этих клеток будет большим вкладом в развитие данной области. Кроме того, считается, что другие типы стволовых клеток – клетки костного мозга и жировой ткани взрослого человека или перинатальные стволовые клетки амниотической жидкости или плаценты обладают менее широким потенциалом дальнейшей дифференциации, но являются более безопасными для процедур клинической трансплантации и могут применятся для аутологичных процедур. При наличии установленного протокола для изолирования, роста и дифференциации, мезенхимальные стромальные клетки (MSCs) тоже могли бы стать многообещающим субстратом для биопечати. Клинически значимые количества мезенхимальных стромальных клеток уже культивировались in vitro в ходе различных экспериментов, а дальнейшие разработки по совершенствованию техник клеточного культивирования сделают возможным использование и других типов стволовых клеток как субстрата для биопечати.

Клетки, используемые для биопечати, должны быть достаточно устойчивыми, чтобы сохранить свою целостность и функциональную активность после самого процесса печати, а также не поддаваться воздействию стресс-факторов различной природы, включая физические силы (механическое раздражение и давление) и факторы биологической природы (наличие токсинов, ферментов и аномальный рН). Многие исследования биопечати использовали как субстрат клеточные популяции, известные своим высоким уровнем пролиферации и повышенной стойкостью – фибробласты и искусственно модифицированные клеточные линии. Эти клетки действительно подходят для исследований с целью доказать обоснованность предложенной концепции, но важно понимать, что технологии биопечати должны быть адаптированы и к применению клеток со значительно меньшей устойчивостью к вышеперечисленным факторам, включая время, необходимое для создания модели. Прогресс в технике клеточного культивирования, перепрограммирования и управления дифференциацией является чрезвычайно важным для дальнейшего создания неиммуногенных клеточных популяций, что будут обладать высоким уровнем пролиферации, стойкостью и необходимой функциональностью.

Примеры биопечатных тканей в масштабе человеческого тела. Заместители кожи и хряща созданы с использованием струйных биопечатных систем, обладающих возможностью производить ткани как in vitro, так и in situ. Сосудистый имплант был создан с использованием микроэкструзионных и расплавленных клеточных сосудистых нитей. Аортальный клапан, также напечатанный с использованием экструзионного метода, состоит из клеток двух типов: мышечных клеток корня аорты и интерстициальных клеток створки аортального клапана. Биорезорбируемая шина дыхательных путей была напечатана лазерным биопринтером, а ранний прототип почки – с помощью, опять же, микроэкструзионного принтера. Все вышеупомянутые ткани в ходе процесса создания требовали объединения многочисленных компонентов для достижения необходимых размеров и функциональности. Все изображения напечатаны с разрешения авторов (указаны в источниках).

Перспективы

Большинство проблем, которые предстоит решить в сфере биопечати, связаны с особыми техническими, материальными и клеточными аспектами самого процесса (Табл.2)

В то же время, несмотря на то, что эта техника в данный момент находится на ранней ступени своего развития, ученым уже удалось создать некоторые ткани в масштабе тела человека, обладающие приближенными к необходимым для трансплантации свойствами (Рис. 3)

ТАБЛИЦА 2

Следующие шаги на пути к успешной 3D-биопечати

Для реализации всего потенциала биопечати необходим прогресс в некоторых технологических сферах, а также в развитии понимания биологических и биофизических основ процесса регенерации in vivo. В таблице перечислены некоторые области, дальнейшие исследования в которых являются крайне необходимыми

 

Cфера	Цели дальнейших исследований
Технологический аспект биопринтера	Совместимость с биологически необходимыми материалами и клетками.Увеличение разрешения и скорости.Увеличение для коммерческого применения.Комбинирование различных технологий для решения технических проблем.
Биоматериалы	Применение комплексных комбинаций для достижения желаемой функциональности, механических и поддерживающих свойств.Модифицирование для облегчения процесса печати с дальнейшим сохранением функций.Использование децеллюляризованных тканеспецифичных каркасов ВКМ для изучения компонентов внеклеточного матрикса.
Источники клеток	Необходимы репродуктируемые источники клеток.Использование комбинаций клеточных фенотипов с различными функциями.Изучение гетерогенных клеточных типов в различных тканях.Непосредственный контроль над процессами дифференциации и пролиферации с помощью малых молекул или других химических веществ.
Васкуляризация	Хорошо развитое сосудистое дерево крайне необходимо для функционирования тканей.Может быть индуцирована в готовой биопечатной модели.Капилляры и микрососуды необходимы для кровоснабжения тканей.Должны обладать подходящими механическими свойствами для противостояния физиологическому давлению и для возможности применения метода хирургического соединения.
Иннервация	Иннервация обязательна для нормального функционирования.Может быть индуцирована после трансплантации модели с помощью фармакологических средств или факторов роста.Может быть достигнута до трансплантации путем использования биореакторов.
Созревание	Время, необходимое для полноценного созревания.Биореакторы могут быть использованы для поддержания тканей in vitro.Использование как факторов созревания, так и физиологических стресс-факторов.Потенциал для преимплантационного тестирования конструкций.

Таким образом, технологические проблемы связаны с необходимостью обеспечения более высокого разрешения, скорости и совместимости с биоматериалами. Поскольку мы двигаемся от модифицирования уже существующих технологий к созданию 3D –биопринтеров, которые будут использовать биоматериалы, могут быть расширены и количество совместимых биокомпонентов, и методы сохранения материалов и клеток при более высоком разрешении и специфичности. Скорость производства должна быть повышена для создания моделей клинически применимых размеров. Одним из способов решения проблемы может быть создание функционирующих тканевых мини-блоков, которые путем объединения обеспечат клинически необходимый размер объекта. Коммерсализация процесса может потребовать создания роботизированных технологий, объединяющих все компоненты производственной линии биопечатных моделей: не только 3D-принтер как устройство, но и процесс изготовления и обработки материалов, клеток и других поддерживающих элементов.

Материалы, что в настоящее время используются для печати, выбирались по 2 критериям: во-первых, на основе данных о совместимости с клеточным ростом и функционированием, а во-вторых, в зависимости от наличия сшивающих и экструзионных свойств. Именно поэтому во многих исследованиях использовалось ограниченное количество материалов: коллаген, гиалуроновая кислота, альгинаты, модифицированные сополимеры и фотоотвержденные акрилаты. Таким образом, основными физико-химическими параметрами, определяющими пригодность гидрогеля для печати являются его реологические характеристики и сшивающие механизмы. Пригодный для биопечати материал должен поддерживать жизнеспособность клеток и их правильное функционирование, обеспечивая таким образом структурную и механическую поддержку модели, быть биосовместимым и легко манипулируемым биопринтером для возможности дальнейшего приобретения 3D-структуры.

Практически все ткани человеческого организма обладают комплексными комбинациями и градиентами элементов внеклеточного матрикса, каждый из которых имеет определенное биологическое и механическое влияние. Возможно, что путем воссоздания естественной биологической среды нужного органа или ткани, большинство механических и функциональных свойств будут также воссозданы. В то же время, кажется невозможным создание единого материала, который будет иметь все свойства для обеспечения функций определенной ткани. Одним из интересных подходов к решению данной проблемы является создание функционально адаптивных материалов, что смогут перепрограммировать свою форму, свойства или функциональность в зависимости от необходимости – в ответ на внешний стимул. Такие материалы будут изменять свои функции как в ответ на сигналы от самого организма в ходе роста органа, так и в ответ на физиологические сигналы. К тому же, такой материал будет реагировать на внешний стимул, созданный специально для воздействия на данную ткань.

Одним из подходов, способных помочь лучше понять функционирование необходимой биосреды, может быть анализ состава и распределения протеинов внеклеточного матрикса в децеллюляризованных клеточных каркасах. Возможность увидеть, изобразить и воспроизвести комплексные 3D-структуры, скопированные с биологически необходимых протеинов экстрацеллюлярного матрикса, была бы значительным продвижением в данной области. Вдобавок к использованию децеллюляризованных тканей для изучения физиологических составов внеклеточного матрикса, сам матрикс, полученный из таких тканей, мог бы служить полезным биоматериалом для целей биопечати. Другим подходом может быть комбинация жестких термопластичных полимерных волокон с мягкими конструкциями из гидрогеля. К тому же, структурные материалы могут быть модифицированы природными или синтетическими факторами, которые будут влиять на функциональность окружающих веществ. Таким образом будут достигнуты и функциональные условия клеточной жизнеспособности, и структурные свойства 3D-тканей.

Временные рамки развития различных типов биопечатных тканей. Существуют 4 типа тканей, которые можно упорядочить по схеме «от простого к сложному» в следующем порядке: двухмерные ткани(кожа) – полые трубки (кровеносные сосуды) – полые органы (мочевой пузырь) – паренхиматозные органы (почки). Поскольку сложность тканей возрастает, необходимы новые подходы для преодоления трудности на пути к их биопечати. Двухмерные органы уже производились и тестировались, и, скорее всего, именно они станут первыми биопечатными органами, что будут трансплантированы пациентам. Полые трубки, например, сосуды, трахея и уретра находятся в процессе развития, и, скорее всего, будут второй ступенью в клиническом использовании биопечатных моделей. Полые органы являются более сложными, и требуют больше времени на создание. Паренхиматозные органы – наиболее сложные структуры, и в процессе их создания на данном этапе нерешенными остаются многие вопросы, особенно практическая сторона обеспечения необходимой васкуляризации и иннервации.

Для биопечати необходимы источники клеток, которые легко будет получить и культивировать. К тому же, клетки должны обладать свойством воспроизводить все функции определенной ткани или системы органов, а также не быть иммуногенными. Потенциально, комбинации различных зрелых иили мультипотентных клеток могут применяться для эффективного воссоздания клеточных фенотипов, необходимых для определенных тканей. Например, популяция стволовых клеток, полученная из функционального компонента интересующей исследователя ткани, может быть использована для создания функционирующих тканевых мини-блоков, в то время как мезенхимальные стволовые клетки, полученные их костного мозга или гестационной ткани, могут создать соединительную ткань, формирущую структурные компоненты органа. К тому же, недавний прогресс в изучении влияния на клетки малых молекул, показывает, что близко то время в будущем, когда ученые будут обладать большим прямым контролем над клеточной пролиферацией и дифференциацией – уже сейчас известны несколько работ, где описывается эффект прямого влияния на клеточную дифференциацию путем использования малых молекул.

Сфера биопечати также сталкивается с трудностями, общими для всех, кто работает с вопросами тканевой инженерии и регенеративной медицины. Например, с важностью обеспечения необходимой васкуляризации созданной модели для длительной жизнеспособности конструкции. Некоторые исследования продемонстрировали возможность создания разветвленного сосудистого дерева для биопечатных конструкций органов. В чем же сложность? Во-первых, в совместимости процесса с материалами, клетками и другими компонентами печатной системы. К тому же, время, необходимое для роста и созревания перфузируемой васкулярной сети через всю тканевую конструкцию может быть более продолжительным, чем, собственно, период жизнеспособности самих клеток. Биореакторы могут обеспечить поддержание жизнеспособности тканевых конструкций и «купить» время, необходимое для постпечатной интеграции тканей, их ремоделирования и созревания. Использование биореактора может комбинироваться с факторами, что способствуют васкуляризации и иннервации, поддержанию и сохранению клеточной жизнеспособности. К тому же, биореакторы необходимы для поддержания параметров микросреды: температуры, рН, концентрации питательных веществ и газов, регуляции специфических механических стимулов. Эти параметры требуют разработки для каждого типа ткани, и должны учитывать цель создания ее биопечатной модели.

Альтернативным подходом к парадигме трансплантации биопечатных моделей является процесс биопечати in vivo, где клетки и материалы в ходе печати размещаются непосредственно в полость тела пациента или на его поверхность. В настоящее время, данный метод использовался в нашей лаборатории для биопечати кожи непосредственно в рану или на ожог, а также другими исследователями для биопечати костей в место повреждения свода черепа у мышей. При повышении скорости работы и разрешения 3D-биопринтеров, этот подход может стать применимым для регенерации тканей in vivo непосредственно после полученных повреждений или во время операции. Одним из интересных направлений развития этой методики может быть потенциальная интеграция 3D-биопринтеров в малоинвазивные роботизированные хирургические инструменты. Устройство, в котором будут объединены технологии роботизированных хирургических инструментов и 3D-биопринтера, сможет извлекать и восстанавливать ткани в ходе одной операции, и, возможно, сократить время заживления тканей после удаления их части в ходе хирургического вмешательства.

3D-биопечатные модели тканей используются не только для целей трансплантологии, но и для изучения влияния наркотических агентов, анализа химических, биологически активных и токсичных веществ, а также для базовых исследований. В ходе движения на пути от простого к более сложному (двухмерные ткани, например, кожа -> кровеносные сосуды -> полые органы, например, мочевой пузырь -> паренхиматозные органы – почки), исследователям предстоит столкнуться с чрезвычайно серьезными проблемами, включая требования к материалам и клеткам, процессы созревания и функционирования тканей, необходимость васкуляризации и иннтервации (см. График 4).

Таким образом, комплексные исследования крайне необходимы для решения этих проблем и дальнейшей реализации всего потенциала 3D-биопечати и, как результат, кардинального преобразования сферы регенеративной медицины.

 

Оригинал статьи

Перевод:

Евгения Лесина

Татьяна Юзвинкевич

Дмитрий Сильнов

Олег Баглюк

Вячеслав Бутиков

Ольга Городилова

Борис Ли

Бросалов Владимир

Редакция:

Борис Ли

Даня Ряскина

Бросалов Владимир

Олег Щербаков