Сантьяго Фелипе Рамон-и-Кахаль: распутанный клубок
Автор: old.medach.pro
Публикация: 18.02.2018
Насколько сложны и труднопостижимы проявления высшей нервной деятельности, настолько же сложна и трудна для изучения организация ее материального субстрата и носителя – головного мозга. Однако наиболее сложно вовсе не макроскопическое строение большого мозга, а его микроскопическая структура, которая стала доступна для изучения только после изобретения микроскопа и разнообразных методик окрашивания, которые продолжают совершенствоваться до сих пор. У истоков всего комплекса дисциплин, изучающих нейрон – а это весьма внушительный список, куда входят нейрогистология, клиническая неврология, нейрофизиология и всевозможные ветви нейробиологии – стоят работы двух гистологов: итальянца Камилло Гольджи и испанца Сантьяго Фелипе Рамон-и-Кахаля. Первый из них создал специфический метод исследования нервной ткани, второй с помощью этого метода с непревзойденной детальностью исследовал и описал гистологическое строение нервной системы, фактически предопределив рождение «нейронной доктрины».
Биография Сантьяго Рамон-и-Кахаля
Сантьяго Фелипе Рамон-и-Кахаль (1852-1934) – испанский врач, физиолог и нейрогистолог, получивший в 1906 году Нобелевскую премию по физиологии и медицине совместно с итальянским гистологом Камилло Гольджи в знак признания их трудов по исследованию микроструктуры нервной ткани. (Портрет Сантьяго Рамон-и-Кахаля, Королевкая академия наук Испании, 1907)
Портрет Сантьяго Рамон-и-Кахаля, Королевкая академия наук Испании, 1907
Родился 1 мая 1852 года в деревне под названием Петилья-де-Арагон, что на юге Пиренеев, в семье бедного парикмахера Джюсто Рамон-и-Касасуса и его жены Антонии. Через 5 лет после рождения сына Джюсто Рамон-и-Касасус, решив стать врачом, переезжает вместе с семьей в Сарагосу. В юности Сантьяго проявлял недюжинные способности к изобразительному искусству и всерьез подумывал стать художником, однако отец настоял на получении им медицинского образования. Из-за непоседливого характера (впоследствии он так напишет о себе в автобиографии «Воспоминания о моей жизни»: «Я прыгал как кузнечик, лазал как обезьяна, бегал как газель») юный Сантьяго не переносил строгой дисциплины колледжа «Отцы медицины» и поэтому начал прогуливать занятия. После ухода из колледжа отец отдал его на обучение к парикмахеру, а затем к сапожнику. Освоив эти профессии, Сантьяго Рамон-и-Кахаль в возрасте 16 лет поступил на медицинский факультет Сарагосского университета. Во время обучения он вместе с отцом, профессором прикладной анатомии, создает анатомический атлас, все рисунки которого были выполнены рукою Сантьяго, однако этот труд не был опубликован.
Анатомические рисунки Рамон-и-Кахаля. Масло, холст, 1872. Фото с выставки «Cajal: Hombre y Ciencia»
После окончания университета в 1873 году и успешной сдачи экзаменов на медицинскую лицензию Рамон-и-Кахаль хирургом поступил на военную службу и в 1874-1875 годах работал на Кубе военным врачом в испанских войсках, посланных на остров для подавления восстания 1868-1878 гг.
Рамон-и-Кахал, капитан медицинской службы. Портрет работы Искьердо Вивеса, 1874.
После двух лет службы он заболел малярией, приступы которой будут преследовать его всю жизнь, из-за чего был демобилизован и вернулся в анатомическую школу при Сарагосском университете, где занял должность ассистента и проводил исследования для своей докторской диссертации. В 1877 году в Мадриде Рамон-и-Кахаль, экстерном сдав экзамены в аспирантуре, получил звание доктора медицинских наук. Там же произошло еще одно событие – не менее значимое и даже, пожалуй, судьбоносное: при сдаче экзамена по гистологии он впервые заглянул в микроскоп. Увиденное настолько поразило его, что Рамон-и-Кахаль, отыскав устаревший микроскоп в своем университете, принялся самостоятельно изучать микроструктуру различных тканей.
В 1879 году Сантьяго Рамон-и-Кахаль занял место директора анатомического музея Сарагосского университета; в том же году он женится на Сильверии Фаньянас Гарсия, от брака с которой у него родилось семеро детей. Двое из них умерли еще при жизни отца (дочь Энрикета, умершая в семилетнем возрасте, и сын Сантьяго, который умер в 27 лет).
Рамон-и-Кахаль с семьей, 1894
В это же время он заразился туберкулезом, однако, пройдя лечение в течение нескольких месяцев, через год выглядел совершенно здоровым. В 1883 году Рамон-и-Кахаль получил должность профессора описательной и общей анатомии в университете Валенсии, которую занимал до 1887 года, когда был назначен профессором гистологии и патологической анатомии в Барселонском университете.
Первыми результатами его увлечения гистологией стали «сумбурные» статьи 1880-х годов, насквозь пронизанные творческой самобытностью автора. Видно, что поначалу его интересует гистология в целом: первая его публикация так и вовсе посвящена вопросам патологии («Экспериментальные исследования вопроса развития воспаления, в особенности миграции лейкоцитов», 1880 г.).
Рисунок из статьи «Экспериментальные исследования вопроса развития воспаления, в особенности миграции лейкоцитов», 1880. Капилляры лягушки, показывающие переход через стенку лейкоцитов
Намеки на будущее дело всей жизни – нейрогистологию – еще несмело проглядывают среди описания органелл, клеток и тканей. Рамон-и-Кахаль не мог довольствоваться сухим каноническим описанием своих наблюдений, и в его статьях мерцательные реснички превращались в колыхающиеся от ветра поля ржи, дендриты нейронов становились щупальцами гигантского кальмара, улавливающими физико-химические сигналы, а протоплазма яйцеклетки представлялась туманностью, обволакивающей «зародыши бесчисленных миров, появление которых суждено для будущих циклов». Но кроме живого метафоричного языка читателей подкупали реалистичные, выписанные с точностью и детальностью дюреровской гравюры, иллюстрации автора. Среди этих статей затерялось и первое крупное открытие Рамон-и-Кахаля – впрочем, совершенно незамеченное современниками – описание сарколеммы кардиомиоцитов (1888 г.).
Статья в журнале «Медицинский вестник Каталонии» с рисунками Рамон-и-Кахаля, демонстрирующими наличие сарколеммы в кардиомиоцитах, 1888
До конца девятнадцатого века считалось, что сарколемма отсутствует в кардиомиоцитах.
Вслед за статьями был опубликован его первый крупный научный труд, также обязанный своим появлением увлечению микроскопией, - «Руководство по гистологии и микрографии» (1889 г).
Руководство по гистологии и микрографии» (1889 г)
Еще через год выйдет прекрасно иллюстрированное «Руководство по общей и патологической анатомии», содержащее настолько детальное изображение гистопатологии, что многие фрагменты не могли быть достойно оценены современниками, поскольку их необходимо интерпретировать только с позиций современной науки. Например, таково описание аденокарциномы молочной железы: «Островки эпителиальной ткани не окружены базальной мембраной… Клетки не прикреплены друг к другу… Это объясняет их инвазивность: так как они свободны от межклеточного цемента, они могут мигрировать через соединительные ткани». В этих строках описаны основные морфологические проявления эпителиально-мезенхимальной трансформации – задолго до открытия сути и механизма этого процесса, обусловливающего способность к метастазированию опухолей. Рисунок Кахаля, сопровождающий описание карциномы молочной железы, считается первым изображением клетки, подвергшейся этой трансформации.
Карцинома молочной железы. Голубым выделена клетка (b), подвергшаяся эпителиально-мезенхимальной трансформации. Рисунок Рамон-и-Кахаля, 1890
В 1886 году, за год до переезда в Барселону, Рамон-и-Кахаль публикует очередную работу – отчет об эпидемии холеры в Валенсии и узнает о новом методе окраски нервной ткани, основанном на принципе импрегнации нервных клеток нитратом серебра, который был разработан итальянским гистологом Камилло Гольджи еще в 1873 году. При использовании этого метода окрашивается лишь небольшая часть всех нейронов образца ткани (примерно 1 из 1000), однако импрегнации красителя подвергаются не только тела клеток, но и все их отростки; это позволяло добиться четкости, немыслимой при ранее известных способах окраски.
Импрегнация серебром по Гольджи. Гистологический препарат
О своих первых впечатлениях от препаратов, окрашенных методом Гольджи, Рамон-и-Кахаль пишет так: «Все было точно, как на эскизе, выполненном китайской тушью на японской бумаге. И подумать только, что это была та же ткань, которая при окраске кармином или гематоксилином представала перед глазом в виде запутанных зарослей. Здесь же, наоборот, все было отчетливо и понятно, как на диаграмме. Ошеломленный, я не мог оторваться от микроскопа».
Пирамидальные нейроны коры головного мозга человека. Рисунок Рамон-и-Кахаля, 1899
В Барселоне Рамон-и-Кахаль продолжил изучение нервной ткани, окрашенной методом импрегнации нитратом серебра, и вскоре ввел в него ряд усовершенствований, а затем разработал несколько собственных способов, позволяющих подробнее исследовать отдельные особенности ткани, такие как нервные окончания или глиальные клетки. И в первую очередь Рамон-и-Кахаль решил исследовать с помощью нового метода мозжечок.
Поперечное сечение извилины мозжечка млекопитающего. Рисунок Рамон-и-Кахаля, 1894
Результаты этих опытов изложены в небольшой статье «Структура нервных центров птиц» (1888 г.), где нашлось место сразу двум революционным открытиям.
Первым стало предположение анатомической самостоятельности нейрона. Еще в конце XIX века большинство ученых были склонны считать, что отростки различных нейронов срастаются друг с другом, формируя единую сеть; этой же точки зрения придерживался сам Камилло Гольджи. Однако Рамон-и-Кахаль, следя за ходом отдельных волокон, заметил, что, хотя многие из них прилежат очень тесно друг к другу, они не сливаются, а скорее соприкасаются, образуя в месте контакта утолщение. Конечно, с помощью светового микроскопа Рамон-и-Кахаль не мог детально рассмотреть синапс и увидеть синаптическую щель, тем самым доказав, что нейроны остаются полностью обособленными на всем своем протяжении и имеют свободные окончания. Поэтому это открытие скорее носило характер озарения, подсказанного логикой и интуицией искушенного наблюдателя, чем четко доказанного научного факта.
Контакт нейрона с отростками (терминалями) других нейронов. Первое изображение синапса. Рисунок Рамон-и-Кахаля, 1903
Вторым было описание дендритных шипиков, которые он называл «espinas». До Рамон-и-Кахаля их считали артефактами, образующими вследствие избыточного отложения серебра: «Кроме того, поверхность дендритов клеток Пуркинье покрыта рифлеными колючками или короткими шипами, которые на терминальных дендритах похожи на небольшие выступы. Раньше считали, что эти возвышения были результатом слишком бурного осаждения серебра; но постоянство их появления и наличие даже в препаратах, окрашенных весьма деликатно, склоняет нас считать их нормальной структурой».
Клетки Пуркинье мозжечка голубя. Ричунок Рамон-и-Кахаля, 1899
В последующих публикациях он показывает, что эти шипики встречаются на дендритах всех нейронов не только птиц, но и млекопитающих. Рамон-и-Кахаль посчитал, что дендритные шипики служат местами контакта с аксонами, многократно увеличивающими их возможную площадь и количество (по аналогии с кишечными ворсинками). Но самое смелое его предположение заключалось в том, что шипики не статичны – они растут при активном использовании и втягиваются при бездействии.
Пирамидальный нейрон. Рисунок Рамон-и-Кахаля, 1899
Впоследствии он разовьет это предположение в гипотезу пластичности нервной ткани, согласно которой в активно используемых областях мозга количество контактов между нейронами увеличивается, тогда как в редко используемых, напротив, уменьшается: «… можно представить, что умственное напряжение способствует большему развитию протоплазменного аппарата и нервных коллатералей в используемой части мозга».
Пирамидальные нейроны, окрашенные метиленовым синим; видны дендритные шипики (b). Рисунок Рамон-и-Кахаля, около 1899-1904
Современники весьма скептически отнеслись к описанию дендритных шипиков даже после приведения весьма убедительных доказательств их существования (обнаружение дендритных шипиков при окраске нейронов метиленовым синим), поэтому Рамон-и-Кахаль вынужден будет отстаивать свою точку зрения до самой смерти.
Примерно в это же время (1890 г.) Рамон-и-Кахаль совершит еще одно принципиально важное открытие: рассматривая поперечный срез спинного мозга четырехдневного куриного эмбриона, он заметил, что дистальный конец растущего аксона имеет специфическую структуру, которую он назвал конусом роста: «Это волокно заканчивается ... расширением, которое может быть округлым и тонким, но также может иметь вид конуса. Этот последний мы будем называть конусом роста, который иногда образует тонкие и короткие расширения ..., которые в внедряются между прилегающими элементами, неуклонно прокладывая путь через межклеточный матрикс». Он предполагал, что рост его ориентирован некими химическими сигналами, что впоследствии также получит подтверждение.
(Тот самый слайд, сохранившийся в Институте Кахаля в Мадриде, рассматривая который Рамон-и-Кахаль пришел к идее конуса роста.
С помощью методов импрегнации Рамон-и-Кахаль получил возможность исследовать и описать такие черты строения нервной ткани, которые до этого были скрыты. Теперь он мог проследить ход каждого нервного волокна и установить его начало и конечную цель.
Изучая нейроны корковых центров зрительного и обонятельного анализаторов, он заметил, что дендриты и аксоны этих клеток ориентированы упорядоченно: дендриты направлены латерально, к внешней среде, а аксоны – медиально, к мозгу. Основываясь на этом наблюдении, Рамон-и-Кахаль в 1891 году формулирует принцип динамической поляризации, согласно которому нейроны способны передавать нервный импульс только в одном направлении: от дендритов через тело клетки к аксону.
Кора головного мозга. Рисунок Рамон-и-Кахаля, 1890-1891
Благодаря селективному прокрашиванию нейронов при использовании метода импрегнации нитратом серебра Рамон-и-Кахалю удается проследить ход и контакты отростков отдельных нейронов и, основываясь на принципе динамической поляризации, распутать этот клубок связей, закономерности которых настолько сложны, что на первый взгляд кажется, будто их и вовсе не существует. Теперь запутанные последовательности контактов отдельных нейронов предстали в виде схематично простых и понятных проводящих путей.
Проводящий путь. Рисунок Рамона-и-Кахаля.
С 1892 года, когда Сантьяго Рамон-и-Кахаль был назначен профессором кафедры гистологии и патологической анатомии Мадридского университета, начинается широкое признание его научных заслуг. Через год, в 1893, Кембриджский университет присвоит ему звание «Почетный доктор» («Doctor Honoris Causa»), а в 1896 он получит премию Фовелла Парижского биологического общества. В 1900 он стал лауреатом премии Московского международного медицинского конгресса, в 1905 он будет награжден Берлинской королевской академией наук золотой медалью Гельмгольца.
Все эти почетные звания и награды стали знаком широкого признания разработанных Рамон-и-Кахалем методов изучения нервной ткани и вклада, внесенного в признание «нейронной доктрины», основным положением которой является морфологическая самостоятельность отдельных нейронов. Гипотеза анатомической суверенности нейрона заставляла предположить иной и более сложный механизм сообщения нервных клеток между собой, нежели простое и очевидное, на первый взгляд, срастание. В 1897 году Майкл Фостер вводит понятие «синапс» для контакта между нейронами, однако механизм передачи нервного импульса в отсутствии срастания нейронов остается неясным. А в 1904-1906 гг. Чарльз Шеррингтон, лично знакомый с Рамоном-и-Кахалем, создает альтернативную теорию, объясняющую, каким образом нейроны могут передавать нервный импульс, не срастаясь друг с другом. Однако мировая наука обязана Рамон-и-Кахалю не только формированием представления о синапсе. В это же время, в 1905 году, В. Вальдеер, во многом основываясь на результатах его исследований, показал, что положения клеточной теории Т. Шванна применимы и к нервной ткани, тем самым доказав состоятельность «нейронной доктрины», согласно которой нервная система представляет собой вовсе не единую сеть из одной гигантской многоядерной клетки, а множество отдельных нервных клеток, и ввел для обозначения этих клеток термин «нейрон».
В 1906 С. Рамон-и-Кахаль вместе с К. Гольджи получит Нобелевскую премию по физиологии и медицине «за работу по изучению структуры нервной системы». В том же году его кандидатура была представлена на должность Министра образования Испании, однако Рамон-и-Кахаль отказался.
Научная работа С. Рамон-и-Кахаля в последующие годы ведется в нескольких направлениях: он обобщает все свои исследования строения нервной ткани в монументальном труде «Нервная система человека и позвоночных», вобравшем почти все его зарисовки, исследует процессы дегенерации и регенерации нервов и открывает в 1913 году новый метод окраски нейроглии с использованием золота.
Нейроглия. Рисунок Рамон-и-Кахаля
Кроме того, он пишет публицистические книги «Беседы в кафе» и «Мир, каким он видится в восемьдесят: впечатления артериосклеротика» - сборники мудрых, ироничных и частенько грустных афоризмов.
В 1932 г. в Мадриде открывается Институт Кахаля, ставший ведущим центром нейробиологии в Испании.
Сантьяго Рамон-и-Кахаль умер 17 октября 1934 года в Мадриде.
Научный вклад Сантьяго Рамон-и-Кахаля
Среди научного наследия Сантьяго Рамон-и-Кахаля важнейшими трудами стали «Руководство по гистологии и микрографии» 1889 года, а также переработанное и дополненное издание этой книги 1897 года, вышедшее под названием «Элементы гистологии»; «Руководство по общей и патологической анатомии», изданное в 1890; «Новые представления о гистологической анатомии и нервных центрах» и «Сетчатка глаза позвоночных», опубликованные в 1894. Однако главным трудом, принесшим Рамон-и-Кахалю наибольшую известность, стала книга «Нервная система человека и позвоночных», появившаяся в результате обобщения его исследований нервной ткани, в разные годы опубликованных отдельными статьями в разнообразных журналах.
Нервная система человека и позвоночных
Исследования микроструктуры нервной ткани, выполненные Рамон-и-Кахалем, доказали нейронную теорию строения нервной системы, что стало залогом дальнейших успехов в ее изучении. Его описания контактов между различными нейронами сыграли важную роль в открытии синапсов, а работы, в которых детально описано строение сетчатки глаза позвоночных, спинного мозга, мозжечка и коры полушарий большого мозга, стали классическими. Кроме того, именно Рамон-и-Кахаль высказал предположение, что нервные клетки не делятся. Его именем названы веретеновидные нейроны первого слоя коры полушарий конечного мозга, впервые описанные им в 1891 году (клетки Кахаля, или клетки Кахаля-Ретциуса), а также клетки, управляющие моторикой желудочно-кишечного тракта (интерстициальные клетки Кахаля). Значителен его вклад в изучение процессов дегенерации и регенерации нервов. Гистологические методики окрашивания различных клеток нервной ткани, разработанные Рамон-и-Кахалем, определили развитие неврологии на десятилетия вперед и обусловили последующее открытие цитоархитектонических формаций коры большого мозга. На основе метода серебрения по Гольджи он разработал целый комплекс различных способов окрашивания нервной ткани, позволяющих детально исследовать нейроны и их отростки – аксоны и дендриты, нейрофибриллы и клетки нейроглии. Кроме того, Рамон-и-Кахаль создал собственную фиксирующую смесь, которой обрабатывал образцы ткани для последующего выявления нейрофибрилл (40 мл пиридина и 30 мл 96% спирта). Принцип методов основан на том, что свежевзятые кусочки ткани сразу или после фиксации спиртом пропитывают раствором нитрата серебра, а образовавшиеся при этом соединения серебра восстанавливают при последующей обработке пирогалловой кислотой или гидрохиноном. Недостатком этих методов является то, что в импрегнированном кусочке пригодной для исследования обычно оказывается лишь средняя зона, так как раствор серебра не проникает в глубокие слои. Наружная зона не может быть исследована вследствие сильного зачернения. Кроме того, часто происходит значительное сжатие ткани, в связи с чем общая сохранность препарата во многих случаях оказывается не слишком хорошей. В новых модификациях метода импрегнации на срезах эти недостатки устраняются. В растворах серебра препараты должны находиться все время в отсутствие света (коричневые склянки с пришлифованными пробками, обертки из картона и т.п.). Кусочки ткани не должны быть толще 3 мм.
За свою жизнь Сантьяго Рамон-и-Кахаль опубликовал около 20 книг и порядка 250 научных статей, в которых подробно рассмотрены различные методики микроскопии, способы фиксации и окрашивания образцов ткани для последующего исследования, а также представлены результаты его работы: описания микроскопического строения спинного мозга, мозжечка, коры полушарий конечного мозга и сетчатки глаза позвоночных, проиллюстрированные замечательными авторскими иллюстрациями, где каждая клетка прорисована до мельчайших деталей. Он впервые зарисовал и описал веретеновидные нейроны первого слоя коры полушарий конечного мозга (1891), а также клетки, управляющие моторикой желудочно-кишечного тракта (1893), названные его именем. Значителен его вклад в изучение процессов дегенерации и регенерации нервов. Гистологические методики окрашивания различных клеток нервной ткани, разработанные Рамон-и-Кахалем, определили развитие неврологии на десятилетия вперед. Труды Сантьяго Рамон-и-Кахаля, в которых он детально описал микроструктуру нервной ткани и в особенности коры большого мозга, стали главным аргументом сторонников нейронной теории строения нервной системы, обеспечившим ее всеобщее признание. Доказательство клеточного строения нервной системы и установление упорядоченного послойного расположения нейронов в коре большого мозга послужило важнейшей предпосылкой для дальнейшего выявления цитоархитектонических формаций коры и установления связи между микроструктурой различных цитоархитектонических полей и их функциональной значимостью. Его вклад в изучение структуры нервной системы был по достоинству оценен большинством научных организаций, в числе которых был и Нобелевский комитет. На церемонии награждения С. Рамон-и-Кахаля и К. Гольджи приветствовали как «главных представителей и лидеров современной неврологии».
Методы окраски нервной ткани по Рамон-и-Кахалю
Метод I
Пригоден для исследования головного мозга мелких животных, а также эмбрионов и новорожденных крупных животных, позволяет выявить пирамидные клетки большого мозга и клетки-зерна мозжечка.- Свежевзятые кусочки ткани помещают на 3 — 5 дней в 0,75 — 3 % раствор нитрата серебра при 35° С до появления табачно-коричневой окраски кусочков.
- Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.
- Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1 — 2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.
- Ополаскивают в дистиллированной воде 5 мин.
- Заливают в целлоидин или парафин.
Метод II
Пригоден для выявления мякотных и безмякотных нервных волокон, перицеллюлярных разветвлений, больших и средних нервных клеток, особенно головного мозга, мозжечка, спинного мозга и, кроме того, двигательных и чувствительных нервных окончаний и регенерационных стадий.- Материал фиксируют в 96 % или 100 % спирте 24 ч.
- Разрезают на кусочки толщиной 2,5—3 мм, импрегнируют 5—7 дней в 1—1,5 % растворе нитрата серебра при 30—35 °С.
- Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.
- Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1—2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.
- Ополаскивают дистиллированной водой 5 мин.
- Заливают в парафин или целлоидин; обезвоживать следует по возможности быстрее (примерно 5-6 ч).
Метод III
Особенно показан для выявления нейрофибрилл спинного мозга, чувствительных симпатических ганглиев человека, кошки, собаки, кролика. Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96% или 100% спирта и 1-12 капель (для большого мозга 1-3 капли, мозжечка - 4, спинного и продолговатого мозга – 8-12, периферических окончаний – 2-3) раствора аммиака (молекулярная масса 0,910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70% спирт, затем на 2-4 ч в 85% спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.Метод IV
Пригоден для выявления безмякотных волокон центральной нервной системы, перицеллюлярных разветвлений, моховидных волокон мозжечка. Материал фиксируют в смеси 15 мл формалина и 85 мл воды; промывают в проточной воде 6-12 ч; помещают на 24 ч в 50 мл 96% спирта, к которому добавлено 5 капель раствора аммиака; обсушивают фильтровальной бумагой; дальнейшую обработку проводят так же, как при использовании метода II.Метод V
Хорошие результаты получают на эмбрионах, а у взрослых прежде всего при изучении нейрофибрилл, нервных окончаний и процесса регенерации нервов (за исключением первых стадий). Материал фиксируют 24 ч в 70% пиридине или смеси, состоящей из 40 частей пиридина и 30 частей 95% спирта; промывают в проточной воде до исчезновения запаха 12-24 ч; переносят на 6-12 ч в 95% спирт; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.Метод VI
Пригоден для изучения двигательных концевых пластинок, перицеллюлярных разветвлений, мозжечка. Материал фиксируют 24 ч в смеси, состоящей из 5 г хлоралгидрата, 25 мл 100% спирта и 75 мл дистиллированной воды; ополаскивают в дистиллированной воде 1 мин; помещают на 24 ч в 50 мл 100% спирта, в который добавлено 4 капли раствора аммиака; промывают 12-24 ч в проточной воде и 2-5 ч в часто сменяемой дистиллированной воде; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.Метод импрегнации замороженных срезов
Этот метод пригоден для исследования большого мозга, мозжечка, двигательных концевых пластинок, чувствительного эпителия.- Материал фиксируют в формалине (1:4) 3 дня или дольше.
- Замороженные срезы толщиной 30-40 мкм собирают в формалин.
- После быстрого (несколько минут) промывания в дистиллированной воде помещают в смесь, состоящую из 12 мл 2% раствора нитрата серебра, 7-10 капель пиридина и 5-6 мл 97% спирта, в которой срезы за 4-6 ч должны стать светло-коричневыми; если этого не происходит, то следует в течение нескольких минут подогреть над пламенем.
- Отдельные срезы на 2-4 с погружают в 100% спирт.
- Восстанавливают 1-3 мин в смеси, в состав которой входят 0,3 г гидрохинона, 70 мл дистиллированной воды, 20 мл формалина и 15 мл ацетона.
- Промывают в воде, золотят и фиксируют как обычно.
- Промывают, извлекают на предметное стекло, обсушивают фильтровальной бумагой.
- Проводят через 100% спирт, гвоздичное масло, ксилол, заключают в бальзам.
Метод выявления волокнистой и астроцитарной глии
Материал фиксируют в 10 % формалине. Срезы толщиной 8 — 10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в свежем 10 % кислом формалине.- Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды).
- Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место.
- Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин.
- Переносят в дистиллированную воду, затем наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, подсушивают на воздухе до полного высыхания.
- Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.
