Эпителиально-мезенхимальная пластичность: центральный регулятор опухолевой прогрессии
Автор: old.medach.pro
Xin Ye and Robert A. Weinberg Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) – основной фактор, обуславливающий злокачественность опухолей. Более того, недавно была открыта связь между процессами ЭМП и приобретением клетками стволовых свойств. Это позволяет сделать вывод о том, что ЭМП является основным механизмом, приводящим к появлению опухолевых стволовых клеток (ОСК), т.е. той субпопуляции опухолевых клеток, которые обуславливают инициацию и развитие заболевания. В этом обзоре мы поговорим о доказательствах важнейшей роли ЭМП в опухолевой прогрессии, а также попытаемся объяснить связь ЭМП с приобретением клетками стволовых свойств. Мы предполагаем, что эпителиально-мезенхимальная пластичность контролируется различными вариантами основной программы ЭМП, и очень важно разобраться в этих программах и в молекулярных механизмах, лежащих в их основе. Программа эпителиально-мезенхимального перехода – естественный процесс трансдифференцировки, который обуславливает эпителиально-мезенхимальную пластичность эпителиальных клеток и способен направить развитие эпителиальных клеток в сторону мезенхимальных. Активация этой программы приводит к тому, что нормальные и опухолевые эпителиальные клетки заселяют компартменты, характерные для стволовых клеток. Программа ЭМП запускается в ответ на различные синергические сигналы микроокружения как при нормальном развитии организма, так и в процессе развития опухоли. Эпителиально-мезенхимальная пластичность критична для опухолевой прогрессии и метастазирования. Ингибирование процессов ЭМП может быть новым терапевтическим подходом к лечению рака.

ЭМП ЯВЛЯЕТСЯ ЕСТЕСТВЕННОЙ ПРОГРАММОЙ ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

В течение последнего десятилетия достигнуты огромные успехи в репрограммировании терминально дифференцированных клеток нормальных тканей в плюрипотентные стволовые клетки. Это привело к возникновению предположения, что практически всегда возможно осуществить дедифференцировку или же трансдифференцировку при условии введения необходимых эктопически экспрессированных транскрипционных факторов в зрелые клетки. Успехи в этих экспериментах по перепрограммированию клеток подняли очень важный вопрос: какие из наблюдаемых нами при этом изменений действительно являются «естественными» (встречающимися в природе), а какие «искусственными» (невозможными в природе при естественных условиях и возникающими при экспериментальном усилении эктопической экспресии генов)? Первой открытой естественной программой трансдифференцировки стала программа эпителиально-мезенхимального перехода, которая обеспечивает приобретение эпителиальными клетками некоторых мезенхимальных свойств и потерю некоторых эпителиальных. При этом существует и обратный механизм перехода – мезенхимально-эпителиальный. Данные, полученные в течение последних двух десятилетий, показали, что процессы ЭМП активируются во время нормального развития тканей и органов и обеспечивают взаимопревращения клеток разных типов, необходимые для формирования сложных тканей и органов животных. Эта клеточная биологическая программа управляется рядом транскрипционных факторов (ЭМП-ТФ), таких как факторы семейств Snail, Twist и Zeb-2. Еще два аспекта ЭМП заслуживают пристального внимания. Во-первых, в некоторых эпителиальных тканях явление ЭМП, по-видимому, связано с присутствием клеток, подобных стволовым. Во-вторых, опухолевые клетки могут видоизменять программу ЭМП, тем самым приобретая клеточные свойства, повышающие их злокачественность. Эти особенности программы ЭМП выявили ранее неизвестную связь онтогенеза и опухолевого патогенеза.

ПРОГРАММА ЭМП И ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ

ЭМП-программа, как следует из ее названия, регулирует изменения состояния клеток с более эпителиального на более мезенхимальное. В случае полного прохождения этой программы эпителиальная клетка становится мезенхимальной. Крайние степени эпителиальной и мезенхимальной дифференцировки имеют определенные отличия, приведенные в таблице 1. Так, можно отметить ключевые свойства эпителиальных клеток: полигональную форму в монослое культуры, поляризованность клеток по апикально-базальной оси и плотное соединение между соседними клетками адгезионными и плотными контактами; in vivo эти контакты обеспечивают структурную целостность слоев эпителиальных клеток. Напротив, мезенхимальные клетки имеют веретенообразную форму без признаков апикально-базальной полярности и слабо соединены с окружающим матриксом через фокальные контакты. Эти особенности мезенхимальных клеток позволяют объяснить их повышенную способность к миграции и инвазии, по сравнению с эпителиальными клетками.  
Таблица 1. Отличия эпителиальных и мезенхимальных клеток
Свойство Эпителиальные клетки Мезенхимальные клетки
Морфология в 2D-культуре Полигональные Веретенообразные, вытянутые
Поляризованность Апикально-базальная Передне-задняя
Подвижность Нет Подвижны и инвазивны
Цитоскелет Экспрессия цитокератинов Экспрессия виментина
Клетка-клеточные соединения Формируют адгезионные и плотные контакты с соседними эпителиальными клетками Не могут формировать адгезионные и плотные контакты; связываются с окружающим внеклеточным матриксом посредством фокальных контактов
  Принципиальные различия между эпителиальными и мезенхимальными клетками обусловлены различиями в соответствующих транскрипционных программах, которые контролируют, помимо прочего, экспрессию ключевых структурных белков, участвующих в поддержании цитоскелета и в образовании межклеточных контактов. Эпителиальные клетки синтезируют различные типы цитокератина, из которого построены их промежуточные филаменты, в то время как мезенхимальные клетки экспрессируют виментин, выполняющий ту же самую функцию. Экспрессия молекул межклеточной адгезии и комплексов поляризации клетки в мезенхимальных клетках, как правило, подавлена. Характерной чертой эпителиально-мезенхимального перехода является замена Е-кадгерина на N-кадгерин, что приводит к ослаблению контактов между клетками. Программа ЭМП активизируется в эпителиальных клетках с необычайно высокой скоростью в ответ на ряд физиологических сигналов, как исходящих из стромы, так и автономных. Например, при гаструляции программа ЭМП инициируется в эпителиальных клетках эпибласта, преобразуя их в мезенхимальные клетки мезодермы под воздействием ряда сигналов – факторов роста фибробластов (FGFs) и сигнального пути Wnt. Подобным образом в тканях взрослого организма программа ЭМП быстро активируется при ранениях, обеспечивая быстрое закрытие раны и восстановление эпителиальных барьеров, необходимых для защиты организма от внешних повреждающих факторов. Такое быстрое взаимопревращение эпителиальных и мезенхимальных клеток предполагает их большую чувствительность к сигналам, вызывающим ЭМП. Кроме того, эпителиальное и мезенхимальное состояния метастабильны, и для долговременного нахождения клетки в одном из них требуется работа сложных молекулярных и клеточных механизмов. Восприятие программы эпителиально-мезенхимального перехода как дискретного переключателя с двумя положениями «эпителиальная клетка» - «мезенхимальная клетка» не отражает работы этой программы, так как при ЭМП в новой «мезенхимальной клетке» остаются ключевые эпителиальные маркеры . Тем не менее, приобретение даже небольшого числа мезенхимальных свойств значительно меняет биологию клетки.

ЭМП И НОРМАЛЬНЫЕ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

Работы последних пяти лет в области ЭМП сходятся в выводах о том, что если эпителиальная клетка хотя бы частично подвергается ЭМП, то она приобретает черты эпителиальной стволовой клетки. По меньшей мере, это оказалось верным в случае клеток молочной железы, как нормальных так и опухолевых.. Учитывая биологическое подобие всех эпителиальных клеток, можно экстраполировать этот вывод и на все эпителиальные ткани. Стволовой характер эпителиальных клеток можно продемонстрировать на основании их способности воссоздавать ткань, из которой они были получены, после их трансплантации в подходящее микроокружение. Например, стволовость нормальных эпителиальных клеток молочной железы может быть оценена по их способности имплантироваться в структуру, образованную жировыми клетками молочной железы (т.е. ту структуру, из которой хирургически удалили древо млечных протоков у молодой самки мыши). После имплантации этих клеток через 6-8 недель образовались структуры «дерева» с протоками, неотличимыми от тех, которые образуются при нормальном морфогенезе молочной железы. Такой успех в формировании молочной железы дает возможность ввести строгий тест на стволовые качества, который, несомненно, подтверждает то, что подвергшиеся ЭМП эпителиальные клетки обладают свойствами стволовых клеток и могут воссоздать целый орган. В другом случае сообщалось, что в результате индукции ЭМП совместным воздействием кратко экспрессируемых ЭМП-ТФ Slug и SRY-Box9 (Sox9, SRY - область, определяющая пол в Y-хромосоме) в популяции нормальных мышиных эпителиальных клеток молочной железы количество стволовых клеток молочной железы увеличивалось в два раза. Дополнительно было показано, что ЭМП-ТФ Slug в норме экспрессируется в базальных и/или аблюминальных слоях млечных протоков мышей и человека: там же, где, как предполагается, располагаются стволовые клетки молочной железы. Анализ с методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией, проведенный на обогащенной с помощью сортинга на проточном цитометре популяции стволовых клеток молочной железы, показал, что располагающиеся в нормальных молочных протоках стволовые клетки экспрессируют транскрипционный фактор Slug (характерный для ЭМП) на уровне на два порядка выше, чем популяция дифференцированных эпителиальных клеток люминального слоя.. Эти наблюдения подтверждают, что по меньшей мере один компонент программы ЭМП может проявляться и в здоровых тканях без патологии, например, при процессах заживления или неоплазии. Найти рациональное биологическое объяснение связи между ЭМП и стволовыми качествами нелегко. Судя по всему, эта клеточная реакция является не недавним изобретением млекопитающих, а возникла еще во времена зарождения царства животных (metazoa). Шаг в сторону понимания этого процесса можно сделать, рассмотрев то, как происходит заживление ран в эпителиальных тканях. Закрытие раны включает в себя миграцию эпителиальных клеток в место дефекта, их пролиферацию и, в самом конце, сборку межклеточных соединений, таких как адгезионные контакты. Считается, что полностью эпителиальные клетки мало подвижны по сравнению с их мезенхимальными аналогами - это говорит о том, что эпителиальные клетки по краям раневого дефекта по крайней мере частично активируют программу ЭМП. Действительно, это было подтверждено на экспериментальной модели рубца в монослое кератиноцитов: по краю нанесенного разрыва эпителиальные клетки экспрессировали характерный для ЭМП транскрипционный фактор Slug. В экспериментах на мышиной модели in vivo также было показано, что в кератиноцитах, локализованных по краям кожной раны, экспрессия Slug повышена. В то же время кератиноциты, полученные от нокаутных по гену Slug мышей, оказались неспособны к закрытию раневого дефекта. Эти исследования подтверждают роль временной активации ЭМП в процессах заживления эпителиальных дефектов. В то же время этим клеткам необходимо ускорить собственную пролиферацию для быстрого закрытия дефекта. Это может потребовать присутствия стволовых клеток, которые образуются путем активации программ ЭМП. Благодаря эпителиально-мезенхимальной пластичности после миграции в область раны и быстрого увеличения популяции эпителиальные клетки, подвергшиеся ЭМП, могут пройти через МЭП для восстановления эпителиального слоя клеток и приобретения исходного эпителиального морфотипа; вероятно, обратный переход сопровождается уменьшением размеров популяции стволовых клеток. На данном этапе все это лишь неточные предположения, но рациональное объяснение вроде этого поможет обнаружить ранее незамеченную связь между ЭМП и свойствами эпителиальных стволовых клеток.

ЭМП И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

Почти 80% всех злокачественных опухолей человека происходят из эпителиальных тканей. Эти опухоли представлены разнообразными нозологическими формами: рак легких, толстой кишки, яичников, молочной железы, поджелудочной железы, предстательной железы, печени, мочевого пузыря, почки. На начальных стадиях клетки этих опухолей продолжают синтезировать цитокератины и E-кадгерин, что подтверждает их эпителиальное происхождение. Помимо этого, опухолевые клетки в ранних опухолях продолжают проявлять биологические свойства, характерные для эпителиальных клеток: они неподвижны и формируют протяженные слои клеток. Эти клетки резко отличаются от тех, которые появляются в дальнейшем в результате так называемой «опухолевой прогрессии». Клетки высокоагрессивных первичных опухолей приобретают свойства мезенхимальных клеток, что проявляется в их способности к миграции, инвазии и, как следствие, к распространению метастазированием. Эти изменения можно объяснить с той позиции, что в результате опухолевой прогрессии в данных клетках активизировались программы ЭМП. Если рассмотреть рак молочной железы как пример, то мы увидим, что приобретение клетками мезенхимальных свойств ассоциируется с более агрессивными подтипами заболевания и опухолевой прогрессией. Еще лучше связь ЭМП и опухолевой злокачественности демонстрирует ряд экспериментов по утрате или приобретению функций на ксенотрансплантатных моделях опухолей. В экспериментах на клеточных линиях опухолевых клеток молочной железы человека и животных удаление ЭМП-ТФ (Twist, Snail и Zeb1 (гомеобокс 1, связывающий E-бокс цинкового пальца)) значительно подавило метастатическое распространение как из мест первичной локализации опухоли (например, из стромальной жировой ткани молочной железы), так и после введения опухолевых клеток в венозное русло (например, в хвостовую вену). И наоборот, эктопическая активация ЭМП с помощью транскрипционных факторов приводит к усилению процессов метастазирования введенных опухолевых клеток Помимо облегчения процессов метастазирования, программа ЭМП играет важную роль в возникновении лекарственной резистентности у опухолевых клеток и рецидивов заболевания у больных раком молочной железы. Так, на мышиной модели Her2-индуцированных опухолей ЭМП-ТФ Snail способен спонтанно активироваться в очагах рецидива опухоли и направлять эти новые опухолевые клетки в сторону мезенхимального развития, что показывает еще один пример связи ЭМП и рецидива заболевания. Связь между программой ЭМП и усилением туморогенеза была продемонстрирована на разнообразных клеточных линиях человеческих опухолей. Имеются данные, что ингибирование эпителиально-мезенхимального перехода с помощью блокирования ЭМП-ТФ Zeb1 подавляет переход опухолевых клеток из состояния низкой онкогенности к более высокой. Интересно, что ряд недавних исследований показал наличие связи между программой ЭМП и приобретением некоторыми опухолями способности подавлять иммунный ответ. В случае меланомы экспрессия ЭМП-ТФ Snail одновременно ингибирует дифференцировку цитотоксических Т-лимфоцитов и индуцирует образование иммуносупрессивных регуляторных Т-лимфоцитов, причем второй эффект опосредован продукцией тромбоспондина. При раке молочной железы активация программы ЭМП в опухолевых клетках приводит к увеличению их резистентности к лизису цитотоксическими Т-лимфоцитами, что частично связано с индукцией аутофагии. В клетках рака легкого активация Zeb1 связана с экспрессией лиганда программируемой гибели-1 (Programmed death-ligand 1 - PD-L1) – иммуносупрессивной молекулы, блокирующей деятельность инфильтрирующих опухоль лимфоцитов. Учитывая множественные эффекты активации программы ЭМП на развитие рака и растущее количество данных об ассоциации ЭМП с разными типами агрессивных раковых клеток, можно резонно предположить, что фактически все раковые опухоли начинают проявлять злокачественность в результате активации ЭМП в опухолевых клетках. Однако данное утверждение может и должно быть рассмотрено критически, так как многие клинические патоморфологи оспаривают само существование программы ЭМП или ее роль в формировании низкодифференцированной карциномы. Значительная часть их недовольства, видимо, происходит из-за технической стороны вопроса. С помощью используемых маркеров очень сложно (а иногда и невозможно) отличить на препарате ткани подвергшиеся ЭМП опухолевые клетки от прилежащих к ним клеток опухолевой стромы: рекрутированных из нормальных тканей фибробластов и миофибробластов, которые в норме экспрессируют маркеры ЭМП. В виду того, что клетки карциномы часто зачастую подвергаются частичному ЭМП, достоверным доказательством участия этой программы в развитии опухоли может служить обнаружение клеток, которые экспрессируют приобретенные мезенхимальные черты одновременно с определенными “остаточными” эпителиальными маркерами, унаследованными от своих полностью эпителиальных предшественников. Действительно, недавние исследования образцов рака молочной железы человека методом гибридизации in situ одновременно на эпителиальные и мезенхимальные маркеры позволили обнаружить клетки опухоли, обладающие как эпителиальными, так и мезенхимальными маркерами при инвазивном раке молочной железы любого подтипа. Кроме того, значительная часть циркулирующих опухолевых клеток, выделенных из периферической крови больных раком молочной железы или раком простаты, также экспрессировали и мезенхимальные и эпителиальные маркеры. Широкое участие программы ЭМП в патогенезе карцином поднимает вопрос о ее возможной роли в развитии некарциноматозных опухолей, встречающихся в клинике. Нейроэктодермальные опухоли, такие как глиомы и глиобластомы, часто имеют мезенхимальные маркеры на своих клетках, включая различные транскрипционные факторы ЭМП, что может свидетельствовать о частичном прохождении ими ЭМП. С точки зрения биологии развития, данное обстоятельство можно объяснить тем, что источником развития этих опухолей является нейроэктодерма - примитивный эпителий. Однако прогрессирование двух других крупных классов опухолей (гемобластозов и мезенхимальных опухолей), по-видимому, не связано с активацией программы ЭМП. Действительно, по меньшей мере в случае сарком клетки (вероятно, клетки похожие на фибробласты и мезенхимальные стволовые клетки (МСК)) постоянно продуцируют ряд транскрипционных факторов ЭМП, по видимому, для поддержания своего мезенхимального состояния. Можно предположить, что нормальные клетки, давшие начало саркоме, прошли через программу ЭМП на ранних стадиях онтогенеза, задолго до развития опухоли. Действительно, примитивные клетки соединительной ткани (т.е. клетки, похожие на МСК) могут быть созданы экспериментально при инициации полного прохождения эпителиальными клетками программы ЭМП. При этом полностью исчезают признаки эпителиального происхождения, которые замещаются на мехенхимальные признаки.

ЭМП И ПЕРЕХОД В СОСТОЯНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Имеется множество сообщений о наблюдениях клеточной неоднородности в различных гемобластозах и солидных опухолях. Одной характерной чертой данной неоднородности является наличие опухолевых клеток с различной способностью инициировать дальнейший рост неоплазии. Клетки с повышенным туморогенным потенциалом были названы «опухоле-инициирующими клетками», «опухолевыми стволовыми клетками» или ОСК, так как их свойства напоминают таковые у естественных стволовых клеток: они могут поддерживать свою популяцию и порождать более дифференцированных потомков. Наличие ОСК можно подтвердить в эксперименте по трансплантации опухолевых клеток в ограниченных разведениях чувствительной к ним мыши. Впоследствии производится оценка наличия опухолей. Этим методом было подтверждено, что инициация ЭМП в клетках опухоли молочной железы человека с помощью кратковременной экспрессии ЭМП-ТФ может привести к увеличению количества ОСК. Эти данные свидетельствуют о том, что программы ЭМП могут играть определенную роль в превращении нестволовых клеток в стволовые как в нормальной ткани молочной железы, так и при развитии в ней опухоли. Важно отметить, что в приведенных исследованиях (практически все они были связаны с искусственной активацией ЭМП-ТФ) не принимался во внимание тот факт, что эти факторы могут активироваться и в естественных условиях, при этом взаимодействуя между собой и обеспечивая процессы ЭМП при различных физиологических состояниях. При экспериментальной индукции ЭМП разработанными на данный момент методиками временная экспозиция и уровни экспрессируемых ЭМП-ТФ значительно отличаются от наблюдаемых в физиологических условиях. Соответственно, популяция ОСК могла бы увеличиться значительно сильнее после активации ЭМП, если бы эти эксперименты проводились в подходящих физиологических условиях. Учитывая многочисленные последовательные шаги, происходящие во время опухолевой прогрессии, которые ведут к изменениям от нормальной клетки до очень злокачественной, можно резонно предположить, что каждая существующая на определенной стадии канцерогенеза (гиперпластической, диспластичекой, аденоматозной и т.д.) популяция клеток содержит свою собственную субпопуляцию стволовых клеток. Свойства этих субпопуляций предположительно должны зависеть от активации определенных вариантов программы стволовых клеток, действующей в нормальных или опухолевых популяциях в зависимости от специфики ткани. Для того, чтобы обеспечить доминирующие на определенной стадии клетки идеальной комбинацией эпителиальных и мезенхимальных свойств и поддержать их в пластичном состоянии, в осуществлении разных вариантов клеточной стволовой программы могут потенциально участвовать различные комбинации ЭМП-ТФ с возможностью поддержания определенного уровня выраженности эпителиально-мезенхимального перехода. Судя по всему, сохранение пластичности очень важно, так как ряд исследований показал, что принудительная экспрессия генов сильных индукторов ЭМП – Twist и фактора Prrx1 (Paired Related Homeobox 1) – нарушает пластичность и блокирует обратный процесс - МЭП, который определяет способность раковых клеток к туморогенезу и образованию метастатических очагов. И наоборот, временная активация ЭМП в нормальных и опухолевых клетках рака молочной железы позволяет им приобрести качества стволовых за счет усиления их эпителиально-мезенхимальной пластичности. Исходя из всего вышесказанного, ОСК (как и нормальные стволовые клетки) имеют промежуточный эпителиально-мезенхимальный фенотип, что позволяет им дифференцироваться как в эпителиальные, так и в мезенхимальные клетки. Если это будет подтверждено, то окажется, что стволовые клетки отличаются от настоящих мезенхимальных клеток, которые полностью дифференцированы в мезенхимальном направлении.

КОНТЕКСТНЫЕ СИГНАЛЫ ИНДУКЦИИ ЭМП В КЛЕТКАХ КАРЦИНОМЫ

Схемы активации ЭМП во время естественного развития показывают, что эта программа должна включаться в ответ на контекстные сигналы (условия среды и сигналы, исходящие от микроокружения), с которыми сталкиваются отдельные клетки различной локализации при развитии эмбриона. Можно также предположить, что в процессах заживления ран и опухолевой прогрессии для активации программы ЭМП тоже используются соответствующие наборы гетеротипических сигналов. В некоторых карциномах можно наблюдать включение программы ЭМП в тех клетках, которые тесно связаны с клетками стромы и формируют «реактивную строму», появляющуюся на поздних стадиях опухолевой прогрессии. В состав поздней стромы входят не только доминирующие в ней фибробласты и миофибробласты, но также и клетки, связанные с заживлением ран и воспалением – мезенхимальные стволовые клетки, макрофаги и лимфоциты. После активации длительное выполнение программы ЭМП в клетках карциномы может зависеть от непрерывных паракринных сигналов, исходящих от клеток стромы. Из этого можно сделать вывод, что опухолевые клетки вернутся обратно в эпителиальное состояние через МЭП при прекращении получения сигналов. Возможен и противоположный вариант: клетки карциномы, которые находятся в состоянии ЭМП, могут поддерживать это состояние путем автономной, независимой от стромы стимуляции с помощью петель положительной обратной связи. Среди этих гетеротипических паракринных сигналов хорошо изучен трансформирующий фактор роста β (TGF-β): цитокин, который преимущественно вырабатывается миофибробластами. Кроме того, имеются данные о других молекулах, способных участвовать в запуске ЭМП: морфогенах Wnt, Notch, Sonic hedgehog (Shh), цитокинах, простагландине Е2 и факторах роста, таких как эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фиобробластов (FGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) . Во многих ситуациях программы ЭМП активируются в ответ на комбинацию нескольких различных паракринных сигналов, чтобы обеспечить избирательную индукцию ЭМП только в тех клетках, которые отвечают определенным требованиям. В рамках нормального развития такой подход обеспечивает активацию ЭМП только в определенных секторах эмбриона. В случае опухолевой прогрессии ЭМП индуцируется и поддерживается совокупностью внешних сигналов из опухолевого микроокружения. (см. схема 1). Действительно, ПГЕ2 может секретироваться фибробластами, миофибробластами и МСК, а лиганд хемокина C-C 18 (CCL18) и эфрин синтезируются макрофагами и моноцитами; TGF-β секретируется миофибробластами и тромбоцитами. На различных экспериментальных моделях было показано, что подавление одного из этих сигналов может привести к ингибированию активации ЭМП и значительно ослабить инициацию опухолевого роста и метастазирование при ксенотрансплантации опухолей. Это подтверждает тезис о том, что ЭМП является сложным многокомпонентным процессом, требующим для своей работы большое количество различных контекстных сигналов. Источник: журнал Cell Источник: журнал Cell Во время опухолевой прогрессии ЭМП индуцируется и поддерживается с помощью комбинации сигналов, действующих как паракринно, так и юкстакринно. Сокращения: MSC – мезенхимальные стволовые клетки.   Разнообразные ЭМП-индуцирующие сигналы, перечисленные выше, активируют экспрессию ЭМП-ТФ, таких как белки семейств Snail, Twist, Zeb, FOX и других. Такое разнообразие путей активации программы ЭМП позволяет предположить, что, возможно, существуют ее различные варианты для морфогенеза определенных тканей и развития определенных типов опухолей. Более того, для регуляции ЭМП существуют несколько посттранскрипционных и эпигенетических механизмов контроля. Например, транскрипционные факторы из семейства Zeb имеют механизм двойной отрицательной обратной связи с семейством микроРНК-200, в результате чего достигается дискретная корректировка положения переключателя «эпителильная/мезенхимальная клетка» в некоторых карциномах. Snail способен подавлять экспрессию микроРНК-34, которая в противном случае может связываться с 3’- нетранслируемой областью мРНК Snail и разрушать его. Программа ЭМП также приводит к глубоким изменениям в транскриптоме клетки путем изменения экспрессии транскрипционных факторов, таких как эпителиальные белки, регулирующие сплайсинг (ESRP), RBFOX, Muscleblind-like (MBNL), CUG-BP- и ETR-3-подобные факторы (CELF) и семейство гетерогенных ядерных нуклеопротеинов (hnRNP), обуславливая производство мРНК, характерных для мезенхимальных клеток. Помимо количества микроРНК, программа ЭМП может менять конфигурацию хроматина, вызывая тем самым длительное устойчивое «молчание» эпителиальных генов в клетках, подвергшихся полному ЭМП. К примеру, Snail способен вызывать накопление и активацию ферментов, модифицирующих хроматин, что приводит к изменению промотора гена Е-кадгерина посредством удаления ключевой метки активной транскрипции (триметилированного H3K4) и замене ее на триметилированный H3K9. Такое изменение приводит к накоплению ДНК-метилтрансфераз, которые, в свою очередь, способствуют метилированию промотора по сайтам CpG и таким образом формируют устойчивый к активации транскрипции конститутивный гетерохроматин. Помимо этих режимов регулирования совсем недавно было показано, что метаболическое перепрограммирование может служить еще одним механизмом самоподдержания программы ЭМП. В частности, индукция ЭМП в клетках опухоли молочной железы человека привела к экспрессии пиримидин-разлагающего фермента дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD), который приводит к накоплению в мезенхимальных клетках дигидропиримидинов. Эти метаболические изменения требуются для активации и поддержания экспрессии программы ЭМП, так как shRNA-опосредованное молчание DPYD или уменьшение внутриклеточной концентрации дигидропиримидинов приводят к ослаблению мезенхимальных свойств, в том числе и способности клеток к инвазии и метастазированию.

ЭМП, ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ И КАСКАД ИНВАЗИИ-МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ

  Поздние стадии прогрессии карцином можно описать как последовательность этапов, именуемую «каскадом инвазии-метастазирования». При этом клетки карциномы в первичных опухолях приобретают способность к инвазии, интравазируют в микроциркуляторные сосуды опухоли, с током крови переносятся к отдаленным частям тела (гематогенная диссеминация), прикрепляются к стенке микроциркуляторных сосудов в этих отдаленных тканях, проникают через стенку микрососудов в паренхиму этих тканей (экстравазация), дают начало микрометастазам и, в ряде случаев, макроскопическим, клинически выраженным метастазам. Этот последний шаг, называемый «колонизация», обычно характеризуется низкой эффективностью. В одной из разновидностей этого каскада лимфатические узлы, дренирующие участки формирования первичной опухоли, выступают в качестве временных хранилищ для опухолевых клеток, которые накапливаются здесь благодаря дренирующим лимфатическим протокам опухоли, тут же и пролиферируют и затем гематогенным путём диссеминируют к отдалённым тканям. В то время как серьезный вклад множества генетических и наследственных эпигенетических нарушений в образование первичной опухоли уже достаточно хорошо изучен, влияние этих изменений на завершение многочисленных этапов каскада инвазии-метастазирования остаётся неясным. Возможно, мутации, ответственные за развитие первичной опухоли, не способствуют прохождению раковыми клетками этапов каскада; зато появляются дополнительные мутантные аллели, повзоляющие клеткам метастатически диссеменировать. Возможен противоположный вариант: генетические (и наследуемые эпигенетические) повреждения, которые несут в себе первичные опухолевые клетки, могут оказаться достаточными факторами для активации в этих клетках программы диссеминации; в соответствии с этим вторым сценарием, некоторые изменения в эпигенетической программе могут самостоятельно стимулировать клетки первичной карциномы  к распространению в отдалённые участки. Если подтвердится второе предположение, это будет значить, что раковые клетки в составе первичной опухоли уже имеют генетические изменения, позволяющие им диссеменировать, и не нуждаются в дополнительных мутациях помимо тех, что уже были отобраны в ходе первичного туморогенеза. В свете последних полученных данных это предположение представляется вполне вероятным. Индукция экспрессии ЭМП-ТФ в неметастазирующей первичной опухоли приводит к повышению способности ее клеток к метастазированию в легкие без внесения дополнительных генетических изменений.  Есть и косвенные доказательства этого предположения: время, необходимое для трансформации аденоматозных полипов прямой кишки в карциномы, равняется в приблизительно 17 годам, однако уже в течение двух или менее лет после этого обнаруживаются метастазы этих карцином в печени .   На основании этого можно сделать вывод, что для трансформации полипа в карциному необходимы достаточно «редкие» мутации, что объясняет такую долгую задержку трансформации, в то время как необходимые для метастатического поражения печени эпигенетические изменения происходят гораздо быстрее. Тем не менее, ни одно из этих доказательств (доклиническое или клиническое) не способно достоверно подтвердить, что именно эпигенетическая активация ранее неактивной программы транскрипции, в том числе ЭМП, привела к распространению опухолевых клеток в отдаленные сайты. Последний шаг каскада инвазии-метастазирования колонизация, по-видимому, не попадает в компетенцию программы  ЭМП. Таким образом, превращение микрометастаза в макрометастаз помимо прочего требует адаптации клеток, возникших в одной полностью дифференцированной ткани, к чужеродному и потенциально “негостеприимному” микроокружению другой, иначе дифференцированной ткани. Например, как клетки рака груди, которые возникают и развиваются в микроокружении, свойственном молочной железе, могут быть адаптированы к выживанию и размножению в совершенно других тканях – в печени, головном мозге, легких или костном мозге? В уже изученные функции ЭМП, по-видимому, не входит приобретение клетками таких адаптивных возможностей, и предполагается, что эти клетки должны приобрести данные способности самостоятельно после своего прибытия в удаленное от очага первичной опухоли место. Действительно, вполне возможно, что такая программа у распространяющихся клеток каждого пациента уникальна и собирается из множества компонентов различных программ дифференцировки. Поэтому программа адаптации клеток к микросреде костного мозга у одной больной с раком молочной железы может отличаться от адаптационной программы у другой больной с идентичным диагнозом. Тот факт, что такую адаптацию сложно приобрести, сочетается с наблюдаемой низкой вероятностью успешной колонизации Хотя до сих пор непонятно, по каким механизмам приобретаются данные адаптивные способности (по генетическим или эпигенетическим), накапливаются свидетельства о том, что для успешной метастатической колонизации необходима программа МЭП. Действительно, отдаленные метастазы, встречающиеся у пациентов с карциномами, чаще всего представлены клетками, проявляющими эпителиальные свойства и даже расположенными характерным для эпителия образом. Следовательно, псевдо-мезенхимальные клетки, служащие основателями отдаленных метастатических колоний, должны обладать способностью к созданию большого числа эпителиальных потомков и организации взаимодействия опухолевых стволовых клеток с другими по аналогии с соответствующей первичной опухолью.  Кроме того, согласно сообщениям о нескольких исследованиях, проведенных на разных моделях опухолей и клеточных линиях, чрезмерная активация ЭМП блокирует МЭП и тем самым предотвращает метастатическую колонизацию. Эти наблюдения показывают, что эпителиально-мезенхимальная пластичность лежит в основе развития опухоли и может использоваться опухолевыми клетками для успешного завершения последнего шага – колонизации отдаленных тканей.  Это напоминает динамические взаимопревращения эпителиальных и мезенхимальных клеток в эмбриогенезе, где ЭМП и последующий за ним МЭП необходимы для развития эпителиальных структур из мезодермы, таких как собирательные трубочки почек (из промежуточной мезодермы) и мезотелиальных мембран (из латеральной пластинки мезодермы).

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Обнаруженная связь между активацией программы ЭМП и приобретением опухолевыми клетками стволовости позволяет сделать вывод о том, что программа ЭМП – ключевой регулятор прогрессии карциномы. Таким образом, помимо традиционного представления об ЭМП как о важном факторе, необходимом для успешного метастазирования, мы должны также взглянуть на программу ЭМП как на прямой фактор инициации опухолевого роста, приводящий к появлению ОСК, способных к метастазированию. Кроме того, эпителиально-мезенхимальная пластичность позволяет клеткам опухоли переключаться между состоянием мезенхимальной ОСК и состоянием более дифференцированной, способной к быстрой пролиферации эпителиальной клетки, что обуславливает гетерогенность опухолевой популяции. Эпителиально-мезенхимальная пластичность подразумевает способность клетки  находиться в промежуточном мезенхимальном состоянии, проявляя различные комбинации эпителиальных и мезенхимальных свойств. Кроме того, в различных типах карцином ОСК обладают повышенной резистентностью к различным лечебным процедурам, включая химио- и радиотерапию.   Устойчивость приводит к увеличению доли ОСК после лечения и зачастую приводит к клиническому рецидиву заболевания. Эти наблюдения объясняют, почему ЭМП и приобретение клетками стволовости все больше и больше привлекают к себе внимание в процессе поиска новых способов лечения прогрессировавших карцином, в большинстве которых рано или поздно появляется поколение клеток, резистентных к терапии, что приводит к летальному исходу. Эти метастабильные, отчасти мезенхимальные состояния, возникающие в различных карциномах, скорее всего контролируются множеством вариантов программы ЭМП, которые отличаются друг от друга комбинациями используемых ЭМП-ТФ, эпигенетическими и метаболическими профилями, а также ауто- и паракринными сигналами, запускающими и поддерживающими их.   Мы полагаем, что будущие исследования определят новые маркеры, которые позволят классифицировать различные промежуточные состояния ЭМП и объяснят, как инициируется и запускается опухолевый рост в различных опухолях и на различных стадиях развития опухоли (подробнее смотреть Главные вопросы). Эти результаты помогут нам разработать более эффективные способы ранней диагностики и лечения злокачественных солидных опухолей.

ГЛАВНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Какие имеются функционально важные отдельные промежуточные клеточные состояния между эпителиальной и мезенхимальной клеткой, возникающие ествественным путем в физиологических и патологических условиях, а особенно в прогрессии карцином?
  2. Какие свойства и/или маркеры помогут идентифицировать эти состояния?
  3. Какие из этих состояний способствуют образованию эпителиальных стволовых клеток?
  4. Какие комбинации транскрипционных факторов ЭМП влияют на данные состояния?
  5. Какие типы контекстных сигналов, действуя в различных комбинациях, приводят к физиологической активации экспрессии ЭМП-ТФ и переходу клеток в более мезенхимальные состояния?
  6. Являются ли подробно описанные для эпителия молочной железы тесные функциональные связи между стволовыми клетками и программой ЭМП общими для всех эпителиальных тканей, или же связь между ЭМП и стволовостью в других опухолях регулируется на основании иных принципов?
  7. Имеются ли еще необнаруженные биологические программы, которые совместно с ЭМП управляют процессом перехода клеток в стволовое состояние и обратно?
  8. Происходит ли активная индукция МЭП специфическими сигналами, или же это процесс, протекающий по умолчанию в случае отсутствия ЭМП-индуцирующих сигналов? Почему эпителиально-мезенхимальная пластичность так важна для поддержания нормальных и опухолевых клеток в стволовом состоянии?
  9. Как можно реверсировать программу ЭМП в целях ликвидации резистентных к терапии опухолевых стволовых клеток?
Оригинал статьи Перевод: Азат Муртазин, Антон Яценко, Муза Гумилева, Полина Тиканова Изображение: Test Page Редакция:  Deepest Depths, Test Page, Азат Муртазин, Даня Ряскина, Зенфира Махмудова, Михаил Гусев, Муза Гумилева, Полина Тиканова ССЫЛКИ
  1.  Takahashi,  K.  and  Yamanaka,  S.  (2006)  Induction  of  pluripotent stem  cells  from  mouse  embryonic  and  adult  fibroblast  cultures  by defined  factors.  Cell  126,  663–676
  2.  Yu,  J.  et  al.  (2007)  Induced  pluripotent  stem  cell  lines  derived  from human  somatic  cells.  Science  318,  1917–1920
  3.  Nieto,  M.A.  (2013)  Epithelial  plasticity:  a  common  theme  in  embryonic  and  cancer  cells.  Science  342,  1234850
  4.  Thiery,  J.P.  et  al.  (2009)  Epithelial-mesenchymal  transitions  in development  and  disease.  Cell  139,  871–890
  5.  Nieto,  M.A.  (2011)  The  ins  and  outs  of  the  epithelial  to  mesenchymal  transition  in  health  and  disease.  Annu.  Rev.  Cell  Dev.  Biol.  27, 347–376
  6.  Tam,  P.P.  and  Behringer,  R.R.  (1997)  Mouse  gastrulation:  the formation  of  a  mammalian  body  plan.  Mech.  Dev.  68,  3–25
  7.  Savagner,  P.  et  al.  (2005)  Developmental  transcription  factor  slug is  required  for  effective  re-epithelialization  by  adult  keratinocytes.  J. Cell  Physiol.  202,  858–866
  8.  Grunert,  S.  et  al.  (2003)  Diverse  cellular  and  molecular  mechanisms  contribute  to  epithelial  plasticity  and  metastasis.  Nat.  Rev. Mol.  Cell  Biol.  4,  657–665
  9.  Theveneau,  E.  et  al.  (2010)  Collective  chemotaxis  requires  contact-dependent  cell  polarity.  Dev.  Cell  19,  39–53
  10.  Guo,  W.  et  al.  (2012)  Slug  and  Sox9  cooperatively  determine  the mammary  stem  cell  state.  Cell  148,  1015–1028
  11.  Mani,  S.A.  et  al.  (2008)  The  epithelial-mesenchymal  transition generates  cells  with  properties  of  stem  cells.  Cell  133,  704–715
  12.  Morel,  A.P.  et  al.  (2012)  EMT  inducers  catalyze  malignant  transformation  of  mammary  epithelial  cells  and  drive  tumorigenesis towards  claudin-low  tumors  in  transgenic  mice.  PLoS  Genet.  8, e1002723
  13.  Morel,  A.P.  et  al.  (2008)  Generation  of  breast  cancer  stem  cells through  epithelial–mesenchymal  transition.  PLoS  ONE  3, e2888
  14.  Scheel,  C.  et  al.  (2011)  Paracrine  and  autocrine  signals  induce  and maintain  mesenchymal  and  stem  cell  states  in  the  breast.  Cell  145, 926–940
  15.  Blanpain,  C.  et  al.  (2007)  Epithelial  stem  cells:  turning  over  new leaves.  Cell  128,  445–458
  16.  Shackleton,  M.  et  al.  (2006)  Generation  of  a  functional  mammary gland  from  a  single  stem  cell.  Nature  439,  84–88
  17.  Stingl,  J.  et  al.  (2006)  Purification  and  unique  properties  of  mammary  epithelial  stem  cells.  Nature  439,  993–997
  18.  Nassour,  M.  et  al.  (2012)  Slug  controls  stem/progenitor  cell  growth dynamics  during  mammary  gland  morphogenesis.  PLoS  ONE  7, e53498
  19.  Shirley,  S.H.  et  al.  (2010)  EMT,  cancer  stem  cells  and  drug  resistance:  an  emerging  axis  of  evil  in  the  war  on  cancer.  Oncogene  29, 4741–4751
  20.  Huber,  M.A.  et  al.  (2005)  Molecular  requirements  for  epithelial-mesenchymal  transition  during  tumor  progression.  Curr.  Opin.  Cell Biol.  17,  548–558
  21.  Rhim,  A.D.  et  al.  (2012)  EMT  and  dissemination  precede  pancreatic  tumor  formation.  Cell  148,  349–361
  22.  Sarrio,  D.  et  al.  (2008)  Epithelial-mesenchymal  transition  in breast  cancer  relates  to  the  basal-like  phenotype.  Cancer Res.  68,  989–997
  23.  Aleskandarany,  M.A.  et  al.  (2014)  Epithelial  mesenchymal  transition  in  early  invasive  breast  cancer:  an  immunohistochemical  and reverse  phase  protein  array  study.  Breast  Cancer  Res.  Treat.  145, 339–348
  24.  Blanco,  M.J.  et  al.  (2002)  Correlation  of  Snail  expression  with histological  grade  and  lymph  node  status  in  breast  carcinomas. Oncogene  21,  3241–3246
  25.  Blick,  T.  et  al.  (2008)  Epithelial  mesenchymal  transition  traits  in human  breast  cancer  cell  lines.  Clin.  Exp.  Metastasis  25,  629–642
  26.  Choi,  Y.  et  al.  (2013)  Epithelial-mesenchymal  transition  increases during  the  progression  of  in  situ  to  invasive  basal-like  breast cancer.  Hum.  Pathol.  44,  2581–2589
  27.  Roy,  S.S.  et  al.  (2014)  Significance  of  PELP1/HDAC2/miR-200 regulatory  network  in  EMT  and  metastasis  of  breast  cancer. Oncogene  33,  3707–3716
  28.  Wu,  Y.  et  al.  (2009)  Stabilization  of  snail  by  NF-kappaB  is  required for  inflammation-induced  cell  migration  and  invasion.  Cancer  Cell 15,  416–428
  29.  Yang,  J.  et  al.  (2004)  Twist,  a  master  regulator  of  morphogenesis, plays  an  essential  role  in  tumor  metastasis.  Cell  117,  927–939
  30.  Zhang,  K.  et  al.  (2013)  The  collagen  receptor  discoidin  domain receptor  2  stabilizes  SNAIL1  to  facilitate  breast  cancer  metastasis. Nat.  Cell  Biol.  15,  677–687
  31.  Tran,  H.D.  et  al.  (2014)  Transient  SNAIL1  expression  is  necessary for  metastatic  competence  in  breast  cancer.  Cancer  Res.  74, 6330–6340
  32.  Cheng,  Q.  et  al.  (2014)  A  signature  of  epithelial–mesenchymal plasticity  and  stromal  activation  in  primary  tumor  modulates  late recurrence  in  breast  cancer  independent  of  disease  subtype. Breast  Cancer  Res.  16,  407
  33.  Creighton,  C.J.  et  al.  (2009)  Residual  breast  cancers  after  conventional  therapy  display  mesenchymal  as  well  as  tumor-initiating features.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  106,  13820–13825
  34.  Oliveras-Ferraros,  C.  et  al.  (2012)  Epithelial-to-mesenchymal  transition  (EMT)  confers  primary  resistance  to  trastuzumab  (Herceptin).  Cell  Cycle  11,  4020–4032
  35.  Moody,  S.E.  et  al.  (2005)  The  transcriptional  repressor  Snail  promotes  mammary  tumor  recurrence.  Cancer  Cell  8,  197–209
  36.  Creighton,  C.J.  et  al.  (2010)  Epithelial-mesenchymal  transition (EMT)  in  tumor-initiating  cells  and  its  clinical  implications  in  breast cancer.  J.  Mammary  Gland  Biol.  Neoplasia  15,  253–260
  37. Chaffer, C.L. et al. (2013) Poised chromatin at the ZEB1 promoter enables  breast  cancer  cell  plasticity  and  enhances  tumorigenicity. Cell  154,  61–74
  38.  Kudo-Saito,  C.  et  al.  (2009)  Cancer  metastasis  is  accelerated through  immunosuppression  during  Snail-induced  EMT  of  cancer cells.  Cancer  Cell  15,  195–206
  39.  Akalay,  I.  et  al.  (2013)  Epithelial-to-mesenchymal  transition  and autophagy  induction  in  breast  carcinoma  promote  escape  from  T-cell-mediated  lysis.  Cancer  Res.  73,  2418–2427
  40.  Akalay,  I.  et  al.  (2015)  Targeting  WNT1-inducible  signaling  pathway  protein  2  alters  human  breast  cancer  cell  susceptibility  to specific  lysis  through  regulation  of  KLF-4  and  miR-7  expression. Oncogene  34,  2261–2271
  41.  Chen,  L.  et  al.  (2014)  Metastasis  is  regulated  via  microRNA-200/ZEB1  axis  control  of  tumour  cell  PD-L1  expression  and  intratumoral  immunosuppression.  Nat.  Commun.  5,  5241
  42.  Tarin,  D.  et  al.  (2005)  The  fallacy  of  epithelial  mesenchymal transition  in  neoplasia.  Cancer  Res.  65,  5996–6000  discussion 6000–5991
  43.  Yu,  M.  et  al.  (2013)  Circulating  breast  tumor  cells  exhibit  dynamic changes  in  epithelial  and  mesenchymal  composition.  Science  339, 580–584
  44.  Husemann,  Y.  et  al.  (2008)  Systemic  spread  is  an  early  step  in breast  cancer.  Cancer  Cell  13,  58–68
  45.  Raimondi,  C.  et  al.  (2011)  Epithelial-mesenchymal  transition  and stemness  features  in  circulating  tumor  cells  from  breast  cancer patients.  Breast  Cancer  Res.  Treat.  130,  449–455
  46.  Kahlert,  U.D.  et  al.  (2013)  Epithelial-to-mesenchymal(-like)  transition  as  a  relevant  molecular  event  in  malignant  gliomas.  Cancer Lett.  331,  131–138
  47.  Tso,  C.L.  et  al.  (2006)  Primary  glioblastomas  express  mesenchymal  stem-like  properties.  Mol.  Cancer  Res.  4,  607–619
  48.  Chang,  H.Y.  et  al.  (2002)  Diversity,  topographic  differentiation, and  positional  memory  in  human  fibroblasts.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci. U.S.A.  99,  12877–12882
  49.  Battula,  V.L.  et  al.  (2010)  Epithelial-mesenchymal  transition-derived  cells  exhibit  multilineage  differentiation  potential  similar to  mesenchymal  stem  cells.  Stem  Cells  28,  1435–1445
  50.  Ocana,  O.H.  et  al.  (2012)  Metastatic  colonization  requires  the repression  of  the  epithelial-mesenchymal  transition  inducer  Prrx1. Cancer  Cell  22,  709–724
  51.  Stankic,  M.  et  al.  (2013)  TGF-beta-Id1  signaling  opposes  Twist1 and  promotes  metastatic  colonization  via  a  mesenchymal-to-epithelial  transition.  Cell  Rep.  5,  1228–1242
  52.  Tsai,  J.H.  et  al.  (2012)  Spatiotemporal  regulation  of  epithelial-mesenchymal  transition  is  essential  for  squamous  cell  carcinoma metastasis.  Cancer  Cell  22,  725–736
  53.  Schmidt,  J.M.  et  al.  (2015)  Stem-cell-like  properties  and  epithelial plasticity  arise  as  stable  traits  after  transient  Twist1  activation.  Cell Rep.  10,  131–139
  54.  Oft,  M.  et  al.  (1998)  TGFbeta  signaling  is  necessary  for  carcinoma cell  invasiveness  and  metastasis.  Curr.  Biol.  8,  1243–1252
  55.  Li,  H.J.  et  al.  (2012)  Cancer-stimulated  mesenchymal  stem  cells create  a  carcinoma  stem  cell  niche  via  prostaglandin  E2  signaling. Cancer  Discov.  2,  840–855
  56.  Lu,  H.  et  al.  (2014)  A  breast  cancer  stem  cell  niche  supported  by juxtacrine  signalling  from  monocytes  and  macrophages.  Nat.  Cell Biol.  16,  1105–1117
  57.  Su,  S.  et  al.  (2014)  A  positive  feedback  loop  between  mesenchymal-like  cancer  cells  and  macrophages  is  essential  to  breast cancer  metastasis.  Cancer  Cell  25,  605–620
  58.  Labelle,  M.  et  al.  (2011)  Direct  signaling  between  platelets  and cancer  cells  induces  an  epithelial-mesenchymal-like  transition  and promotes  metastasis.  Cancer  Cell  20,  576–590
  59.  Brabletz,  S.  and  Brabletz,  T.  (2010)  The  ZEB/miR-200  feedback loop–a  motor  of  cellular  plasticity  in  development  and  cancer? EMBO  Rep.  11,  670–677
  60.  Burk,  U.  et  al.  (2008)  A  reciprocal  repression  between  ZEB1  and members  of  the  miR-200  family  promotes  EMT  and  invasion  in cancer cells. EMBO Rep. 9, 582–589
  61.  Hill,  L.  et  al.  (2013)  ZEB/miR-200  feedback  loop:  at  the  crossroads
of  signal  transduction  in  cancer.  Int.  J.  Cancer  132,  745–754
  1.  Brabletz,  T.  (2012)  MiR-34  and  SNAIL:  another  double-negative feedback  loop  controlling  cellular  plasticity/EMT  governed  by  p53. Cell  Cycle  11,  215–216
  2.  Kim,  N.H.  et  al.  (2011)  A  p53/miRNA-34  axis  regulates  Snail1-dependent  cancer  cell  epithelial-mesenchymal  transition.  J.  Cell Biol.  195,  417–433
  3.  Shapiro,  I.M.  et  al.  (2011)  An  EMT-driven  alternative  splicing  program  occurs  in  human  breast  cancer  and  modulates  cellular phenotype.  PLoS  Genet.  7,  e1002218
  4.  Tam,  W.L.  and  Weinberg,  R.A.  (2013)  The  epigenetics  of  epithelial- mesenchymal  plasticity  in  cancer.  Nat.  Med.  19,  1438–1449
  5.  Lin,  Y.  et  al.  (2014)  Epigenetic  regulation  of  EMT:  the  Snail  story. Curr.  Pharm.  Des.  20,  1698–1705
  6.  Shaul,  Y.D.  et  al.  (2014)  Dihydropyrimidine  accumulation  is  required for  the  epithelial-mesenchymal  transition.  Cell  158,  1094–1109
  7.  Fidler,  I.J.  (1978)  Tumor  heterogeneity  and  the  biology  of  cancer invasion  and  metastasis.  Cancer  Res.  38,  2651–2660
  8.  Fidler,  I.J.  (2003)  The  pathogenesis  of  cancer  metastasis:  the seed  and  soil’  hypothesis  revisited.  Nat.  Rev.  Cancer  3,  453–458
  9.  Calabrese,  P.  et  al.  (2004)  Pretumor  progression:  clonal  evolution of  human  stem  cell  populations.  Am.  J.  Pathol.  164,  1337–1346
  10.  Jones,  S.  et  al.  (2008)  Comparative  lesion  sequencing  provides insights  into  tumor  evolution.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  105, 4283–4288
  11.  Klein,  C.A.  (2009)  Parallel  progression  of  primary  tumours  and metastases.  Nat.  Rev.  Cancer  9,  302–312
  12.  Cameron,  M.D.  et  al.  (2000)  Temporal  progression  of  metastasis  in lung:  cell  survival,  dormancy,  and  location  dependence  of  meta- static  inefficiency.  Cancer  Res.  60,  2541–2546
  13.  Chambers,  A.F.  et  al.  (2002)  Dissemination  and  growth  of  cancer cells  in  metastatic  sites.  Nat.  Rev.  Cancer  2,  563–572
  14.  Luzzi,  K.J.  et  al.  (1998)  Multistep  nature  of  metastatic  inefficiency: dormancy  of  solitary  cells  after  successful  extravasation  and  limited survival  of  early  micrometastases.  Am.  J.  Pathol.  153,  865–873
  15.  Malanchi,  I.  et  al.  (2012)  Interactions  between  cancer  stem  cells and  their  niche  govern  metastatic  colonization.  Nature  481,  85–89
  16.  Thiery,  J.P.  (2002)  Epithelial-mesenchymal  transitions  in  tumour progression.  Nat.  Rev.  Cancer  2,  442–454
  17.  Chaffer,  C.L.  et  al.  (2011)  Normal  and  neoplastic  nonstem  cells  can spontaneously  convert  to  a  stem-like  state.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci. U.S.A.  108,  7950–7955
  18.  Gupta,  P.B.  et  al.  (2011)  Stochastic  state  transitions  give  rise  to phenotypic  equilibrium  in  populations  of  cancer  cells.  Cell  146, 633–644
  19.  Singh,  A.  and  Settleman,  J.  (2010)  EMT,  cancer  stem  cells  and drug  resistance:  an  emerging  axis  of  evil  in  the  war  on  cancer. Oncogene  29,  4741–4751
  20.  Gupta,  P.B.  et  al.  (2009)  Identification  of  selective  inhibitors of  cancer  stem  cells  by  high-throughput  screening.  Cell  138, 645–659
  21.  Caramel,  J.  et  al.  (2013)  A  switch  in  the  expression  of  embryonic EMT-inducers  drives  the  development  of  malignant  melanoma. Cancer  Cell  24,  466–480