Довольно скоро мы узнаем, можно ли с помощью генной инженерии излечить ряд крайне тяжелых заболеваний, связанных с нарушением синтеза гемоглобина.

Мэттью Портеус (Matthew Porteus) вспоминает первый в своей практике случай серповидно-клеточного криза. Молодая женщина страдала от глубокой, сильной боли в одной из ее конечностей. Такая боль, вызванная закупоркой кровеносных сосудов, часто встречается у людей с серповидно-клеточной анемией.

Выяснив, чем больна пациентка, Портеус понял, в чем кроется причина ее проблем — это точечная мутация в одном из генов, кодирующих часть гемоглобина — белка, переносящего кислород и присутствующего в эритроцитах. Но ни он, ни любой другой врач не могли помочь пациентке чем-либо, кроме снятия боли. «Мы знаем, что серповидно-клеточная анемия связана с конкретным геном и конкретными клетками, но все, что мы можем сделать — это обеспечить регидратацию и снять боль», — говорит Портеус. Он знал, что его пациентка и другие подобные больные вновь будут страдать от болевых кризов и нарастающего поражения органов и будут возвращаться в больницу.

Встреча с этой пациенткой вдохновила Портеуса на исследования в области гематологии и изучение серповидно-клеточной анемии. Теперь он и другие исследователи хотят «перевернуть игру» для таких пациентов. Они надеются излечить серповидно-клеточную анемию еще в детском возрасте путем редактирования генов гемоглобина в стволовых клетках красного костного мозга ребенка, который после этого можно трансплантировать обратно. Идея заключается в том, что однократная (хотя и довольно сложная) процедура может на всю жизнь избавить детей с серповидно-клеточной анемией от длительных вынужденных пропусков учебы и работы, посещения больниц и повреждения органов. «Чтобы лечение было эффективно в долгосрочной перспективе, необходимо исправить сами стволовые клетки», — говорит Портеус, педиатр-гематолог в Стэнфордском университете (Калифорния). Такое восстановление гена потенциально может устранить необходимость в госпитализации таких пациентов.

Чтобы починить ген, исследователи используют технологию редактирования генов CRISPR. В 2016 году несколько групп исследователей изменили гены, связанные с гемоглобином, в гемопоэтических стволовых клетках — предшественниках всех клеток крови — у пациентов с серповидно-клеточной анемией, а некоторые из этих групп даже начали трансплантировать модифицированные клетки мышам.

Многие лаборатории и компании подают заявки на проведение клинических испытаний различных методик на основе CRISPR. Для работы с серповидно-клеточной анемией исследователи должны одновременно применить две относительно непроверенные технологии — не только редактирование генов, но и терапию стволовыми клетками. Многое зависит от этих первых запланированных испытаний, поскольку они станут наиболее ранней проверкой клинической эффективности и практичности редактирования генов. «Мы хотим стать тем камнем, который повлечет за собой лавину: разработать модель лечения и других генетических заболеваний», — говорит Джейкоб Корн (Jacob Corn), директор по научным биомедицинским исследованиям Института Инновационной Геномики при Калифорнийском университете в Беркли.

Молекулярное заболевание

Гематологов особенно расстраивает отсутствие лекарства от серповидно-клеточной анемии, поскольку это заболевание встречается достаточно часто и хорошо изучено.

Дефект гемоглобина, лежащий в основе развития серповидно-клеточной анемии, описан в 1949 году Лайнусом Полингом и его коллегами [1]. Полинг же придумал термин «молекулярное заболевание» для описания этиологии серповидно-клеточной анемии. Восемь лет спустя исследователь обнаружил расположение и природу [2] мутации в гене, кодирующем β-глобин — один из двух типов субъединиц гемоглобина у взрослых. Впоследствии ученые изучили эту мутацию и показали, что она заключается в однонуклеотидной замене аденина на тимин. Сама молекула гемоглобина состоит из четырех частей: двух субъединиц β-глобина и двух субъединиц α-глобина. Когда обе копии гена β-глобина человека содержат мутацию, гемоглобин в их эритроцитах полимеризуется и искажает клетки, придавая им характерную серповидную форму.

Примерно для 10 % пациентов с серповидно-клеточной анемией возможна пересадка костного мозга от здорового HLA-совместимого донора (чаще всего — члена семьи). Однако это изнурительная процедура: перед пересадкой пациенты должны пройти курс химиотерапии, чтобы подавить свой собственный костный мозг. Тем не менее, такой подход обеспечивает излечение детей примерно в 90 % случаев.

Если бы исследователи могли исправлять стволовые клетки пациентов с помощью редактирования генов, а затем пересаживать модифицированные клетки обратно, к потенциальному лечению получили бы доступ гораздо больше пациентов. В настоящее время разрабатываются два таких подхода (см. рисунок «Редактирование генов с помощью CRISPR»), показавших свою перспективность в прошлом году в исследованиях на мышах.

Первый подход направлен на исправление мутации в гене β-глобина, вызывающей болезнь. Второй же способствует продукции фетального гемоглобина, то есть формы гемоглобина, преобладающей у плода в утробе матери. Фетальный гемоглобин образован иной комбинацией субъединиц и не содержит β-глобин. Кроме того, он сильнее связывается с кислородом, чем гемоглобин взрослого человека, что помогает плоду получать кислород из крови матери. Однако у большинства людей после рождения продукция фетального гемоглобина прекращается и вместо этого начинает вырабатываться гемоглобин, содержащий β-глобин. Оказывается, что у пациентов, больных серповидно-клеточной анемией, но имеющих более слабые ее проявления, присутствуют генетические варианты, которые обеспечивают продукцию фетального гемоглобина и во взрослом возрасте. «Фетальный гемоглобин — один из ключевых факторов, определяющих тяжесть заболевания», — говорит Виджай Санкаран (Vijay Sankaran), педиатр и биолог, изучающий стволовые клетки, из Гарвардской медицинской школы в Бостоне, штат Массачусетс.

Если бы врачи могли редактировать гемопоэтические стволовые клетки пациента (либо для исправления мутации в β-глобине, либо для возобновления продукции фетального гемоглобина), а затем использовать их для повторного заселения костного мозга, исчезла бы необходимость поиска совместимого донора костного мозга, и лечение могли бы получить гораздо больше пациентов.

«Настало время, когда мы действительно сосредоточимся на излечении этого заболевания», — говорит Джон Тисдейл (John Tisdale), гематолог из Национального института сердца, легких и крови США в Бетесде, штат Мэриленд. «Для этого у нас есть все инструменты.»

При серповидно-клеточной анемии эритроциты имеют характерную удлиненную форму.

Редактирование строки

Идеальный подход, говорит Портеус, заключается в том, чтобы исправить мутацию, которая вызывает болезнь. Восстановление или замена гена β-глобина — идея не новая, однако исследователей обнадеживает относительная легкость CRISPR-технологии, быстро достигшей успеха в моделях на мышах.

Материалы, необходимые для CRISPR-технологии, легко доступны. Исследователям нужны лишь разрезающий ДНК фермент, такой как эндонуклеаза Cas9, и молекула направляющей РНК, которая «указывает» ферменту, какой ген следует вырезать. Затем вместо того, чтобы оставить клетку в покое и позволить ей своими силами провести склонную к ошибкам репарацию вырезанных CRISPR участков, исследователи руководят процессом восстановления, предоставляя клетке цепочку ДНК, содержащую исправленный фрагмент последовательности гемоглобина, которая словно указывает «повторяй за мной». Этот подход называется гомологически направленной репарацией.

Одним из затруднений, говорит Портеус, является введение направляющей ДНК в клетку. Если подействовать на клетку электрическим полем, которое временно раскроет клеточную мембрану, и в этот момент внедрить «голую» молекулу в клетку, то эта молекула долго не просуществует. Клетка чувствует вторжение и разрушает «чужую» ДНК. Чтобы противостоять этому, исследовательская группа Портеуса вдохновляется генной терапией: для доставки руководства по восстановлению в виде кольцевой ДНК, называемой плазмидой, они используют вирус.

В ноябре 2016 года команда успешно использовала в вирусы для редактирования гемопоэтических стволовых клеток пациентов с серповидно-клеточной анемией in vitro. «Мы можем исправить гены в 40–70 % клеток», — говорит Портеус. Но после того, как эти клетки пересаживают мышам с подавленной иммунной системой, их количество падает. Лишь 10 % человеческих клеток, пересаженных в костный мозг мышей, дают начало эритроцитам с нормальным гемоглобином [3].

Другая группа — коллаборация исследователей из нескольких филиалов Калифорнийского университета — использует иную стратегию доставки. Они «обстреливают» клетки одноцепочечной направляющей ДНК, которая не запускает механизм разрушения. В работе, опубликованной в октябре 2016 года, исследователи показали, что такие стволовые клетки также приживаются у мышей и продуцируют нормальные эритроциты [4].

Обе группы работают с FDA для разработки и планирования клинических испытаний. Но прежде чем они попытаются бороться с серповидно-клеточной анемией у детей, им необходимо проверить процесс редактирования генов для взрослых, «поскольку мы не имеем ни малейшего представления о том, сработает ли это», — говорит Дональд Кон (Donald Kohn), педиатр, исследующий стволовые клетки, из Калифорнийского университета, Лос-Анджелес, и лидер проекта Калифорнийского университета.

На другом конце Соединенных Штатов две стартап-компании, нацеленные на применение CRISPR-технологии, начинают изучать, как они надеются, менее рискованный подход — вмешательство в гены, регулирующие фетальный гемоглобин. CRISPR Therapeutics и Editas Medicine, расположенные в Кембридже, штат Массачусетс, надеются использовать редактирование генов для усиления продукции фетального гемоглобина.

Реактивация продукции фетального гемоглобина проще, чем исправление гена β-глобина, поскольку в этом случае гомологически направленная репарация не требуется. После того, как редактирующий фермент разрежет ген, работа исследователей завершится. В дело вступит механизм репарации ДНК клетки, который снова «клеит» разрезанную цепочку, как правило, сделав при этом несколько ошибок, которые послужат гарантией того, что ген больше не будет работать. Этот подход можно использовать для направленного нарушения функции репрессоров, таких как BCL11A, что позволит отредактированным клеткам начать производить фетальный гемоглобин [5].

Самарт Кулкарни (Samarth Kulkarni), президент CRISPR Therapeutics, говорит, что его компания выбрала этот путь, поскольку такой процесс редактирования проще, чем исправление гена β-глобина. Основной целью компании являются серповидно-клеточная анемия и другая распространенная гемоглобинопатия, β-талассемия, и Кулкарни надеется, что успех в этой области откроет путь для клинического применения CRISPR.

CRISPR Therapeutics исследует пять семейств генов, связанных с супрессией фетального гемоглобина, в том числе BCL11A. На ежегодном конгрессе Европейской Гематологической Ассоциации в июне 2017 г. компания представила результаты работы с нормальными гемопоэтическими стволовыми клетками человека и мышами-реципиентами. Они сообщили, что нужный ген был успешно отредактирован более чем в 80 % клеток, которые при пересадке мышам с подавленной иммунной системой продолжали существовать в течение 20-недельного исследования. В 2018 году компания планирует провести клинические испытания в Европе и начать с пациентов с β-талассемией, более распространенной в Европе, чем в Соединенных Штатах.

Тем временем Editas Medicine представили результаты своей работы над генами фетального гемоглобина на ежегодном собрании Американского общества генной и клеточной терапии в мае 2017 г. Эритроциты, полученные из отредактированных гемопоэтических стволовых клеток пациентов с серповидно-клеточной анемией, производили на 25 % больше фетального гемоглобина, чем неотредактированные клетки и, кроме того, отредактированные клетки успешно прижились у мышей.

Известные неизвестные

Полученные результаты восхищают ученых и клиницистов, однако вызывают и беспокойство. Некоторые из ученых опасаются, что плохое понимание как биологии стволовых клеток, так и молекулярных деталей репарации генов замедлит внедрение результатов такой работы в клинику. Другие обеспокоены потенциально высокой стоимостью таких методов лечения.

Но CRISPR — не единственная технология, которую пытаются применить для редактирования генов с целью излечения серповидно-клеточной анемии. «Больше сложностей возникает со стволовыми клетками», — говорит Кон. Терапия стволовыми клетками не так нова, как CRISPR-технология, но пока не готова к применению и имеет свои проблемы.

Как утверждает Кон, настоящие гемопоэтические стволовые клетки хрупкие и встречаются редко. С ними трудно работать, так как они находятся в состоянии покоя, то есть не растут и не делятся. Как только эти клетки начинают расти, они превращаются в более специализированные клетки и утрачивают особенности стволовой клетки. Чтобы убедиться в том, что исследователи редактируют правильные клетки, а стало быть, нет риска побочных эффектов, необходимо провести проверку этих клеток, что подразумевает длительное их выращивание вне тела. Это значит, что у клеток появляется больше возможностей утратить свой потенциал дифференцировки во множество типов клеток, включая эритроциты. При этом во время трансплантации костного мозга такой проблемы не возникает, поскольку клетки не подвергаются длительному хранению вне тела. По словам Кона, при работе с гемопоэтическими стволовыми клетками в чашке Петри в ходе процесса редактирования генов «вы беспокоитесь о том, как бы не заставить клетки дифференцироваться».

Другая неопределенность заключается в том, насколько хорошо клетки приживутся в костном мозге человека, а также как долго они просуществуют. В исследованиях на мышах пересаженные клетки продолжали свое существование в течение нескольких месяцев. Однако на данный момент ни одно исследование не показало, что клетки способны выживать в течение времени, достаточного для обеспечения нормального функционирования после пересадки человеку.

Корн, участвующий в проекте Калифорнийского университета, говорит, что его группа продлевает исследования на мышах, чтобы лучше изучить жизнеспособность отредактированных клеток в долгосрочной перспективе. Стремясь точнее имитировать продолжительность жизни человека, они последовательно пересаживают одни и те же клетки от мыши к мыши несколько раз. Исследователи хотят убедиться, что клетки все еще обладают характеристиками стволовых, а нежелательные последствия, такие как образование опухолей, отсутствуют.

Чтобы более реалистично оценить технологию и ее потенциал у человека, Тисдейл планирует проверить редактирование генов серповидно-клеточной анемии на приматах. «В ходе моделирования на мышах успех, как правило, преувеличивается», — говорит он. Также важно показать, что значительная часть отредактированных клеток приживается надолго. Его работа по трансплантатам костного мозга для взрослых с серповидно-клеточной анемией помогла установить, что в костном мозге должны приживаться по крайней мере 20 % отредактированных клеток. Если этот уровень окажется ниже — как показывают исследования на мышах, проведенные на сегодняшний день — останется неясным, сможет ли редактирование генов обеспечить лечение.

Остается много вопросов об основах редактирования генов. «Необходимо больше фундаментальных исследований по репарации ДНК», — говорит Корн. Он обеспокоен тем, что технология редактирования генов предполагает слишком много проб и ошибок. Ученый утверждает, что исследователи должны выявить не только что работает, но и почему. Считается, что небольшие изменения вызывают целый каскад последствий: для того, чтобы процесс редактирования генов стал успешным, необходимо отредактировать одну конкретную цепь ДНК из двух, каждая деталь оборудования должна быть тщательно настроена, и каждый шаг в протоколе должен выполняться с особой точностью. Корн говорит, что сейчас его коллектив и другие группы начинают детальное исследование необходимых шагов.

Даже если клинические испытания окажутся успешными, и пациенты будут излечены, терапия серповидно-клеточной анемии, основанная на редактировании генов, скорее всего, по-прежнему будет дорогостоящей. В отличие от массового производства препарата, который можно назначить множеству людей, клеточная терапия должна подбираться индивидуально для каждого пациента и проводиться под тщательным контролем, в стерильных условиях в специализированных учреждениях. Кулкарни утверждает, что преимущества излечения компенсируют вложенные средства — не только в плане улучшения качества и продолжительности жизни пациентов, но и благодаря устранению необходимости в дальнейших (сопряженных с финансовыми тратами) переливаниях крови, паллиативной помощи и лечении разнообразных последствий повреждения органов. По сравнению с этим, считает исследователь, крупные, но разовые траты гораздо более выгодны. «Это будет дорого, но в системе найдутся средства», — говорит Кулкарни.

Тем не менее, большинство людей с гемоглобинопатиями живут в развивающихся странах и не смогут платить, утверждает Санкаран. По оценкам ВОЗ, средняя продолжительность жизни людей с серповидно-клеточной анемией, например, в Африке составляет менее пяти лет из-за ограниченного доступа к вакцинам, антибиотикам и безопасным переливаниям крови. «Даже если мы добьемся успеха в редактировании генов, мы не сможем излечить всех пациентов», — говорит Санкаран.

Однако Санкаран по-прежнему ожидает, что эта работа приведет к результатам, которые смогут принести пользу самым бедным пациентам. В ходе разработки различных нацеленных на гены стратегий для лечения серповидно-клеточной анемии исследователи много узнают о фундаментальной биологии заболевания, а потребностям пациентов уделяется долгожданное внимание. Санкаран говорит, что новые сведения могут помочь в создании синтетических препаратов, которые легче изготовить и распространить среди большого числа людей по сравнению с терапией стволовыми клетками. С этим согласен Джордж Мерфи (George Murphy), биолог, изучающий стволовые клетки, из Бостона, штат Массачусетс. «Что нам действительно нужно — это новые препараты», — говорит он.

Едва ли можно сомневаться в том, что клиницисты рады лавине исследований серповидно-клеточной анемии, которые ближе, чем когда-либо, подходят к эффективным методам лечения пациентов, таких как молодая женщина, произведшая такое впечатление на Портеуса в начале его карьеры. И Портеус с нетерпением ждет того дня — возможно, через десять или более лет — когда он сможет говорить об относительных преимуществах различных подходов к редактированию генов для лечения этих заболеваний.

«Трудно предсказать, что будет работать и окажется успешным, а где возникнут проблемы», — говорит Санкаран. «Но как врач, я радуюсь такой возможности для моих пациентов, ибо чем больше мы сделаем, тем больше мы узнаем».