Обойтись без доноров
Использование стволовых клеток и искусственных кровезаменителей может снизить потребность в донорстве.
Каждый год медсестры в примерно 13000 центрах крови по всему миру собирают примерно 110 миллионов доз донорской крови из вен здоровых добровольцев. Этого объема достаточно, чтобы заполнить 20 олимпийских бассейнов, однако такие цифры даже близко не отвечают потребностям медицинских учреждений в цельной крови и ее компонентах. Группа ученых, в которую входят биоинженеры и изучающие стволовые клетки биологи, надеется восполнить недостачу за счет безопасного, надежного, а главное — бесперебойного производства кровезаменителей в лабораториях.
По словам Роберта Ланзы, пионера в области терапии стволовыми клетками, возглавляющего направление глобальной регенеративной медицины компании Astellas Pharma в Мальборо, Массачусетс, современные технологии еще не готовы заменить натуральный продукт. «В ближайшее время мы не планируем отнимать хлеб у банков крови», — говорит он. Но в ближайшем будущем может быть разрешено использование искусственных компонентов крови в ситуациях, когда переливание донорской крови или ее компонентов невозможно, к примеру, в условиях боевых действий или у людей, которые отказываются от трансфузий по религиозным соображениям. Методы лечения, основанные на перепрограммировании стволовых клеток в целях получения форменных элементов крови также могут помочь центрам переливания крови компенсировать нехватку доноров или избежать передачи инфекций с донорской кровью. Более того, возможно, что нуждающимся в пересадке костного мозга пациентам больше не придется подбирать иммуносовместимых доноров.
«Прогнозируется значительная нехватка крови, ведь поступления уменьшаются, а спрос из-за старения населения только растет, — говорит Джонатан Яр, анестезиолог медицинской школы Дэвида Геффена в Университете Калифорнии, Лос-Анджелес. — Большинство этих продуктов могут заполнить критически важную нишу: применение в особых случаях, когда переливание крови недоступно или неприемлемо».
Тромбоциты, вероятно, будут первым компонентом крови, произведенным из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC, тип стволовых клеток, полученных при генетической перестройке зрелых клеток. — прим. перев.) и вошедшим в третью фазу клинических испытаний.
В частности, это связано с огромной медицинской потребностью в этих спасительных «лейкопластырях в кровеносном русле», ведь они часто используются у пациентов, которым необходима пересадка органов, химиотерапия, остановка или профилактика кровотечения. Потребность в тромбоцитах усугубляется ограничениями их хранения. По современным протоколам тромбоциты тромбоциты для сохранения их структуры и функций можно хранить только при комнатной температуре, так что срок их хранения составляет всего лишь 5 дней. Поэтому банки крови сталкиваются с неприятной ситуацией: когда кончается срок хранения тромбоцитов, их нужно выбрасывать, — а запасы тромбоцитов в больницах могут кончиться именно тогда, когда они наиболее необходимы: после массовых несчастных случаев или катастроф, чрезвычайной ситуации в сфере здравоохранения или же просто при снижении донорских поступлений.
Использование iPSC в других условиях было ограничено из соображений безопасности. В частности, регулирующие органы запрещали клинические исследования производных iPSC из-за опасений, что процесс перепрограммирования клеток может сделать их канцерогенными. «Эти опасения не касаются тромбоцитов, произведенных из iPSC», — говорит Мортимер Понц, гематолог детской больницы Филадельфии в Пенсильвании. Он отмечает, что тромбоциты не имеют ядер, а, значит, не содержат ДНК, необходимой для развития мутаций и опухолей. И даже если случится, что полноценные ядерные клетки контаминируют линию производства тромбоцитов, существует простое решение этой проблемы, которое не скажется на функции тромбоцитов. «Достаточно облучить полученный продукт, — говорит Понц, — ведь это убьет нежелательные клетки, но не повредит тромбоциты».
Отсутствие канцерогенности привлекло к использованию iPSC-технологий в деле создания заменителей тромбоцитов несколько компаний, включая Megakaryon Corporation в Киото, Япония, и PlatOD в Париже, Франция. «Это действительно идеальный вариант для первого применения плюрипотентной терапии», — говорит Ланза. Но вырастить большое количество тромбоцитов не так уж просто.
Ученым нужно превратить iPSC в «материнские» клетки тромбоцитов — мегакариоциты, которые у человека находятся в костном мозге. Дальше нужно «уговорить» эти клетки выпустить покрытые «бусинами» нитевидные отростки, называемые протромбоцитами. Из этих «бусин» и получаются тромбоциты.
Группе ученых из Японии, возглавляемой Хиромицу Накаучи и Коджи Это, исследователями стволовых клеток и сооснователями Megakaryon, впервые удалось получить рабочие тромбоциты из человеческих плюрипотентных стволовых клеток около 10 лет назад. Получить мегакариоциты оказалось не так уж сложно, но в неволе каждый из них давал лишь два-три тромбоцита, что не идет ни в какое сравнение с тысячами их, создаваемыми собственными мегакариоцитами человеческого организма.
С тех пор протоколы улучшились, но этого все равно недостаточно для того, чтобы сделать возможным крупномасштабное производство. «Самым большим затруднением в нашей области является то, что нам не удается заставить мегакариоциты продуцировать достаточно тромбоцитов, чтобы сделать это коммерчески оправданным», — говорит Джонатан Тон, один из основателей Platelet Biogenesis в Бостоне, Массачусетс, компании, целью которой является испытание полученных из iPSC тромбоцитов в клинических исследованиях.
Банк крови Британской Армии в Египте во время второй мировой войны
Притворяясь тромбоцитом
Альтернативой попроще может быть создание полностью синтетических тромбоцитов. Эшли Браун, биоинженеру в университете Северной Каролины в Рэйли, удалось создать из мягкого гидрогеля искусственный тромбоцит, который прилипает к нитям фибрина, одного из основных белков, участвующих в формировании кровяного сгустка. На крысиной модели травматического повреждения эти тромбоцитоподобные частицы остановили кровотечение значительно быстрее, чем свежие тромбоциты, которых было в 100 раз больше.
Впрочем, Браун предупреждает, что до сих пор она еще не тестировала агрегантные свойства своих тромбоцитов ни на одном животном больше крысы. «Уже после перехода на свиней, — говорит она, — динамика может сильно изменится, и мы можем получить довольно неожиданные результаты».
Эрин Лавик, инженер полимерных материалов в университете Мэриленда, Балтимор, знает об этом не понаслышке. Ей довелось тестировать тромбообразующие наночастицы одновременно на крысах и свиньях. Экспериментальная терапия имела триумфальный успех на крысах, но в еще не опубликованных экспериментах на свиньях искусственные тромбоциты быстро вызвали иммунную реакцию и расширение сосудов, из-за чего кровотечение только усиливалось, а рана не могла закрыться.
Биолог Джозеф Италиано, изучающий тромбоциты в Брайхэме и Женском госпитале в Бостоне, приветствует разработки по созданию искусственных тромбоцитов, но сомневается в том, что им удастся сравняться с настоящими тромбоцитами, даже если будет подтверждена их полная безопасность. «В прошлом десятилетии, — говорит он, — ученые начали понимать, что тромбоциты не только останавливают кровотечение». Они также участвуют в регенерации тканей, ремоделировании кровеносных сосудов и иммунном ответе. «Проще перечислить то, к чему они не имеют отношения», — говорит Италиано, который является соучредителем Platelet Biogenesis вместе с Тоном. И так как многие функции тромбоцитов пока не до конца изучены, «сложно воссоздать их с нуля».
Тон присоединился к лаборатории Италиано в 2008 году, после получения докторской степени в университете Британской Колумбии в Ванкувере, Канада, где он разрабатывал способы продления срока хранения тромбоцитов. Но нарастающее разочарование в существующей системе, основанной на донорской крови, подтолкнуло его к решению посвятить себя проблеме выращивания тромбоцитов в лаборатории. Он сосредоточил свои усилия на разработке микрожидкостного устройства, позволяющего получать больше тромбоцитов с мегакариоцита, чем было возможно при выращивании их в клеточной культуре.
В 2014 году Тон сообщил, что его биореактор-на-чипе, состоящий из крошечных силиконовых каналов, воссоздающих некоторые физиологические характеристики костного мозга, продуцирует около 30 тромбоцитов на мегакариоцит, что от трех до восьми раз больше, чем было достигнуто исследователями из Megakaryon или PlatOD. Тон продолжал работать в Брайхэме вплоть до августа 2017 года, а после решил посвятить все свое время исследованиям в Platelet BioGenesis.
Он и его команда ученых в настоящее время сосредоточены на улучшении системы получения тромбоцитов с помощью биореактора. По словам Лиа Белью, биолога-исследователя тромбоцитов, в прототип уже внесены четыре крупных изменения. «Сейчас мы работаем над модульной структурой устройства», — говорит Белью, демонстрируя змеевидные каналы, испещряющие толстый пластик последней модели биореактора.
Один из ключевых вопросов состоит в том, какие клетки помещать в биореактор. Предполагается, что используемая клеточная линия должна хорошо переносить множественные деления. Брэд Дикстра, биолог стволовых клеток в Platelet Biogenesis, провел большую часть последних девяти месяцев, оценивая потенциал трех одобренных для использования в клинике клеточных линий iPSC для создания тромбоцитов в лаборатории. «Каждая из наших клеточных линий имеет свои особенности», — объясняет Дикстра, перемещая пластинку с культурой ткани под микроскоп, чтобы показать слипшийся в форме Австралии комок клеток в фазе роста. Эта клеточная линия больше всего подходит для создания мегакариоцитов, в то время как мегакариоциты, полученные из другой линии, производят больше протромбоцитов. Третья клеточная линия — это что-то вроде низкопробного бунтаря. «Мы называем ее нашим трудным подростком», — говорит Дикстра.
Теперь перед Тоном стоит непростая задача: он должен выбрать, какая из клеточных линий будет использоваться в биореакторе в дальнейшем. Он надеется начать исследования на животных в начале 2018 года, а через пару лет после этого перейти к клиническим испытаниям. «На сегодняшний день, — говорит Тон, — мы идем точно по графику»
Красная тряпка
После выращенных в лаборатории тромбоцитов следующими этапом могли бы стать эритроциты. Красные кровяные тельца можно было бы получать от универсального донора, и это позволило бы переливать их людям с любой группой крови. Лабораторная эритроцитарная масса также свела бы на нет риск передачи инфекции с трансфузией, что становится очень серьезной проблемой, когда появляются патогены, для выявления которых еще не существует надежных тестов (см. «Скрининг: в крови»).
Но даже если исследователям удастся разработать успешный протокол дифференцировки и созревания, большую часть рецепта еще только предстоит разработать. Экономические факторы также складываются не в пользу повсеместного внедрения выращенных эритроцитов. Как подмечает Марк Тернер, медицинский директор Шотландской национальной службы переливания крови в Эдинбурге: «Не существует пока способа производить эритроциты так, чтобы масштабы и цена оказались приемлемыми». Тернер возглавляет консорциум Novosang, целью которого является массовое производство эритроцитов из iPSC. «Мы, безусловно, не можем сделать это сейчас, — говорит он. — Мы даже не близко».
Выход эритроцитов при сдаче крови значительно выше, чем тромбоцитов, поэтому лабораторные эритроциты должны не только показать свою эффективность, но и быть достаточно дешевы в получении. Кроме того, донорские эритроциты могут хранится в холодильнике до шести недель, а в морозильных камерах и того дольше. Это дает банкам крови и больницам определенную свободу в управлении своими запасами, что не представляется возможным в случае с тромбоцитами.
Вместо того, чтобы пытаться конкурировать с обильным и недорогим пулом донорских эритроцитов, Линжао Чен, биолог стволовых клеток в Медицинской Школе Университета Джона Хопкинса в Балтиморе, Мэриленд, «ищет сферу применения» для своих эритроцитов, получаемых из iPSC. В одном из проектов Чен сотрудничает с Джоном Робаком, медицинским директором банка крови больницы университета Эмори в Атланте, Джорджия, для создания персонализированных эритроцитов, выращенных из собственных стволовых клеток людей, страдающих серповидноклеточной анемией.
Исследователи сосредоточились на этой группе заболеваний крови из-за высокого риска иммунной реакции на донорские компоненты крови у людей с таким диагнозом. У 2–5 % от общего числа реципиентов вырабатываются антитела к несоответствующим белковым маркерам на поверхности эритроцитов. Однако у людей с серповидноклеточной анемией, которая чаще всего поражает выходцев из Африки, но лечится инфузиями компонентов донорской крови преимущественно от белых доноров, нежелательные иммунные реакции происходят намного чаще и встречаются примерно у каждого третьего.
Многие из этих пациентов нуждаются в регулярных переливаниях для улучшения кислородтранспортной функции их крови, но могут найти только нескольких совместимых доноров. «Для таких пациентов персонализированный источник совместимых эритроцитов может оказаться крайне рентабельным, несмотря на свою дороговизну, — говорит Робак. — Эритроциты, полученные из iPSC, могут резко увеличить наши возможности для лечения их анемии».
Более дешевой альтернативой могут быть кровезаменители-переносчики кислорода. Хотя продукт на основе клеток более предпочтителен для людей с серповидноклеточной анемией, бывают ситуации, когда искусственная кровь, лишенная живых клеток (а значит, и их хрупкости), является «тем, что доктор прописал». Так, в условиях боевых действий более 90 % предотвратимых смертей связаны с неконтролируемой кровопотерей, и кровезаменители, обеспечивающие оксигенацию тканей «здесь и сейчас» и восполняющие потери в состоянии шока, могли бы спасать жизни. Важно отметить, что такой продукт должен оставаться стабильным долгое время и без охлаждения.
«Что-то, что может быть подвергнуто сухой заморозке и храниться при температуре окружающей среды — вот что нужно», — говорит Алан Доктор, педиатр-реаниматолог, который разрабатывает биосинтетический искусственный эритроцит в Медицинской школе Университета Вашингтона в Сент-Луисе, Миссури. То же можно сказать и о таких нередких ситуациях, как: жизнеугрожающее состояние у человека в отдаленном регионе; пациент, чья религия не одобряет переливания крови; и даже скорая помощь в городских условиях — по крайней мере как временное решение, пока пациент не будет доставлен в больницу. «Медику нужно было бы просто развести его с водой, встряхнуть и ввести, — объясняет Доктор. — Тогда его можно использовать в каком то дальнем переулке в Фаллудже, на круизном корабле, на Марсе, на подводной лодке — где угодно».
В двух словах
Проект Доктора по разработке сублимированного кровезаменителя ведет дочерняя компания KaloCyte в Сент-Луисе, сооснователем которой он является. Продукт, известный как ErythroMer, состоит из полимерной оболочки, которая окружает молекулы гемоглобина (выделенного из человеческих эритроцитов путем лишения их клеточной мембраны) и маленькой молекулы, которая облегчает последующее выделение кислорода. Важно отметить, что оболочка беспрепятственно пропускает кислород, в то же время замедляя диффузию оксида азота — сигнальной молекулы, которую «голый» гемоглобин может связать. Такое связывание приводит к спазмированию сосудов — в чем и была проблема с некоторыми неинкапсулированными переносчиками кислорода на основе гемоглобина, многие из которых не ушли дальше этапа клинических исследований. (см. Вставку «Общая проблема кровезаменителей»)
На собрании международного общества по транспортировке кислорода к тканям в Урбана-Шампейн в августе 2017 года Доктор и Дипанджан Пан, сооснователь ErythroMer, химик-синтетик из Университета Иллинойса, сообщили, что их продукт быстро стабилизировал уровни кислорода на крысиной модели геморрагического шока. Кровезаменитель также выводил оксид азота из крови медленнее, чем обычные эритроциты. «Мы с осторожным оптимизмом надеемся совершить прорыв», — говорит Доктор.
В 2017 году две группы исследователей в США вплотную приблизились к лабораторному получению стволовых клеток крови. Команда, возглавляемая Джорджем Дейли, биологом стволовых клеток в Детской Больнице Бостона, разработала метод, позволяющий превращать человеческие iPSC в клетки, имеющие все внешние признаки стволовых клеток крови. Впрочем, их профиль экспрессии генов не полностью совпадает с таковым у истинных стволовых клеток крови, и выращенные в лаборатории клетки не приживаются так же хорошо как те, которые получают из костного мозга и пупочного канатика. «Это “усталые” стволовые клетки крови», — говорит Дейли.
Шахин Рафий и его коллеги из колледжа Уэилл Корнелл Медикал в Нью Йорке, добились больших успехов в создании качественных стволовых клеток крови, используя выделенные из легких мыши клетки. В сотрудничестве с Хансом-Питером Киемом, исследователем клеточной терапии в Центре Исследования рака имени Фреда Хатчинсона в Сиэтле, Вашингтон, Рафий и его команда проверяют, сработает ли тот же метод на адипоцитах новорожденной макаки. По словам Рафаэля Лиса, исследователя из лаборатории Рафия, команда достигла успеха в создании небольших количеств стволовых клеток крови макаки in vitro. «Прямо сейчас мы работаем над увеличением культуры и получением клинически значимого количества клеток», — говорит он.
Позднее в этом году они планируют ввести около полумиллиона выращенных в лаборатории стволовых клеток крови той же обезьяне после уничтожения ее собственного костного мозга. Если клетки приживутся, будут самообновляться и произведут здоровые иммунные клетки и остальные компоненты крови без нежелательных побочных эффектов, можно предположить, что следующим этапом будут испытания на человеке.
Вставка: общая проблема кровезаменителей
В истории клинических разработок кислородпереносящих кровезаменителей были как взлеты, так и падения. Первый такой переносчик кислорода, HemAssist, как выяснилось на этапе поздних клинических исследований, увеличивал смертность пациентов с тяжелыми и жизнеугрожающими травмами. А самая настоящая этическая буря разгорелась, когда другой экспериментальный препарат, PolyHeme, ввели пациентам без сознания, которые не могли дать на это своего согласия.
Но заключительный удар по этим переносчикам кислорода на основе гемоглобина (haemoglobin-based oxygen carriers, HBOC) нанес мета-анализ 2008 года, согласно которому эти кровезаменители значительно увеличивают риск летального исхода и сердечного приступа. Класс препаратов был забракован целиком. «Это приостановило развитие целой отрасли на 10 лет», — говорит Джонатан Яр, анестезиолог в Университете Калифорнии, Лос Анджелес.
Но были и возражения. «Мета-анализ имел серьезные недостатки», — говорит Колин Маккензи, анестезиолог и физиолог в Медицинской Школе Университета Мэриленд, в Балтиморе. В редакцию посыпались письма, в которых авторов обвиняли в том, что они собрали вместе рандомизированные исследования пяти различных HBOC, которые имели разные свойства, а их тестирование проводилось на разных выборках и при различных условиях.
В новостях сообщали о том, как во внутреннем отчете ВМС США раскритиковали Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) за то, что они отклонили заявку на дальнейшее тестирование одного из ведущих НВОС. Примечательно, что Яр и Маккензи обнаружили, что простое изъятие препарата HemAssist из результатов мета-анализа может перевернуть его выводы с ног на голову. Не все НВОС были опасны — только один давно забытый препарат.
Но ущерб уже был нанесен. В 2009 году Норсфильдские лаборатории Эванстона, Иллинойс, занимавшиеся разработкой PolyHeme, объявили о банкротстве. Так же поступил и другой крупный игрок того времени, Biopure из Кембриджа, штат Массачусетс. Русский промышленник выкупил активы Biopure за 4 млн долларов и создал ОПК Biotech. Впрочем, через 5 лет и эта компания оказалась в тяжелом финансовом положении и была продана, чтобы стать HbO2 Therapeutics, со штаб-квартирой в Судертоне, штат Пенсильвания.
«HbO2 распространяет свой НВОС в клиники по всему миру на благотворительной основе», — говорит главный исполнительный директор и соучредитель Джерри Ковальски. Hemopure, продукт на основе бычьего гемоглобина, был одобрен для использования в Южной Африке, где его ввели более чем 2,000 людям. В США и Европе доступен ветеринарный препарат для собак. В 2018 году Ковальски надеется начать третью фазу клинических испытаний в США, чтобы протестировать применение Hemopure в качестве лечения анемии у людей, которым невозможно перелить донорскую кровь, например, Свидетелей Иеговы или больных серповидноклеточной анемией, у которых развилась иммунная реакция на трансфузию эритроцитов. НВОС на основе гемоглобина человека, коровы или даже личинки (Arenicola marina) не сильно отличаются друг от друга.
Производство кровезаменителя Hemopure в HbO2 Therapeutics
«Мы лучше разобрались в сложной химии НВОС, и есть надежда, что это понимание приведет к уменьшению их токсичности», — говорит Абду Алаяш, эксперт по кровезаменителям в FDA в Бетеcде, Мэриленд.
Хотя коммерческий интерес к технологии поутих, некоторые компании зацепились за идею производства кровезаменителя. «Это огромная возможность», — говорит Абрахам Абуховски, главный исполнительный директор и ведущий научный сотрудник в Prolong Pharmaceuticals, в Южном Плейнфилде, Нью-Джерси. У Prolong Pharmaceuticals есть свой собственный переносчик кислорода, Sanguinate, который сейчас находится во второй фазе клинических исследований. «Есть много состояний, при которых необходимо что-то подобное».
