Клиническая химия: гемостазиология

Знание данной темы необходимо врачу любого профиля. Уже с первых курсов каждому студенту становится ясно, что схему вторичного (да и первичного) гемостаза необходимо знать наизусть и уметь нарисовать, даже проснувшись среди ночи. 

Как и всегда, начнем с того, как правильно проводить забор крови для данного типа анализа. В этом случае необходимо проводить тесты в условиях, близких к in vivo, поэтому в пробу чаще всего добавляют цитрат. При концентрации цитрата 0,105 ммоль/л (3,2 %) он способен связать все ионы кальция. Если обычно можно сделать забор миллилитром больше-миллилитром меньше, то в данном случае необходимо строго следовать предписаниям производителя пробирки и лаборатории, с которой работает ваша клиника. Наполнить пробирку необходимо точно до штриха, потому что в лаборатории тест начинается с добавления ионов кальция к крови, что снова запустит гемостаз. Соотношение цитрата к плазме крови должно быть 1:9 при показателях гематокрита от 25 до 60 %. При значениях больше или меньше необходимо сперва посоветоваться с лабораторией. ЭДТА оказывает то же воздействие, что и цитрат, но из-за большего аффинитета к ионам кальция его при данном методе анализа не используют. Иногда используют ингибиторы тромбина, но только в случаях, когда концентрация кальция в пробе непостоянна, например, при различных тромбоцитопатиях.

К самой процедуре забора крови тоже есть рекомендации: нельзя надолго прерывать кровоток и сильно затягивать ремешок — все это может стимулировать гемолиз и приводить к ложным результатам. Если не удастся избежать забора крови из ЦВК, то рекомендуют сперва провести анализ 10 мл крови. Часто через ЦВК проводят инфузионные гепариновые терапии в стационарных условиях, поэтому высок риск загрязнения пробы гепарином. В интенсивной медицине (point-of-care-testing) разрешают использовать кровь из капилляров, но перед этим из вышеизложенных причин нельзя тереть место пункции. 

Не все тесты проводятся с использованием цельной крови. Чаще всего пробу сперва центрифугируют при комнатной температуре со скоростью вращения 2000–2500 g 10–15 минут. Хранить же ее рекомендуют при 4°С. В определенных условиях возможно длительное хранение при –80°С. Для диагностики патологий тромбоцитов рекомендуется центрифугирование со скоростью 150–200 g в течение 15–20 минут. Такая богатая тромбоцитами плазма может храниться не более часа. 

В норме концентрация тромбоцитов составляет 140 000–360 000 в микролитре крови. Если тромбоцитов становится менее 50 000 в мкл, то это проявляется клинически в виде геморрагического диатеза и склонности к кровотечениям. На слизистой полости рта можно увидеть небольшие петехии. Такая тромбоцитопеническая пурпура может появляться при потере тромбоцитов вследствие кровотечения. При подозрении на тромбоцитопению (снижение концентрации тромбоцитов менее 140 тыс. в мкл) рекомендуют сперва осмотреть глазное дно пациента на предмет мелких петехий — эту процедуру может выполнить любой студент уже при первичном осмотре, не дожидаясь результатов лабораторного анализа. Амегакариоцитозом называют снижение образования тромбоцитов из-за недостатка тромбопоэтина чаще всего вследствие нарушения функций печени, где тот синтезируется. Тромбоцитоз (более 400*10^9 в литре крови) чаще всего можно наблюдать после спленэктомии или сильного кровотечения. Тромбоцитемией называют постоянное увеличение тромбоцитов (более 600*10^9 в л). Причиной этому бывают метастазы опухолей. 

Диаметр тромбоцитов составляет 1–4 микрометра, толщина — 0,5–2 микрометра. Продолжительность циркуляции в кровяном русле — 8–14 дней. Тромбопоэтин гепатоцитов и цитокины (интерлейкин-11) влияют на рост мегакариоцитов в костном мозге, образование тромбоцитов. Разрушением тромбоцитов занимается селезенка, а также печень и легкие. 

Под микроскопом тромбоциты выглядят плоскими и лишены ядра. Однако не стоит забывать, что они содержат эндоплазматический ретикулум и митохондриальную РНК. В тромбоцитах различают гиаломер и грануломер. Гиаломером называют зону под мембраной, содержащую сократительные миофиламенты (актин, миозин и тропомиозин), грануломером — зону с органеллами, гранулами и гликогеновыми везикулами. Различают гранулы нескольких типов. В альфа-гранулах содержатся протеины из плазмы крови, которые попадают туда с помощью системы канальцев внутри тромбоцита, а также фибриноген (фактор I), проакцелерин (фактор V), антигемофильный глобулин А (фактор VIII) , антигепариновый фактор PF4, фактор Виллебранда, тромбоспондин (большой гликопротеин), фибронектин, трансформирующий фактор роста (ТФР), фактор роста эндотелия сосудов, а также бета-тромбоглобулин, альбумин, калликреин, альфа-2-антиплазмин. В плотных гранулах содержатся АТФ, АДФ, ГТФ, ГДФ, серотонин, кальций и неорганический фосфат. В тромбоцитах присутствуют лизосомы, ферменты которых представлены в большинстве своем кислыми гидролазами (бета-гексозаминидаза, бета-галоктазидаза, бета-глюкоронидаза, бета-арабинозидаза, бета-глицерофосфатаза, арилсульфатаза, гепариназа). Также тромбоциты в больших количествах содержат фермент тромбоксан-синтазу, что позволяет им превращать арахидоновые кислоты клеточных мембран в тромбоксаны. 

Тромбоцитопатиями называют врожденные дефекты тромбоцитов, такие как нарушения структуры гранул тромбоцитов (синдром серых тромбоцитов при дефектах альфа-гранул и болезнь недостаточности пула накопления при дефектах плотных гранул). Псевдотромбоцитопения чаще всего является результатом проведения анализа с использованием сосуда, содержащего ЭДТА, а не цитрат. Тромбастенией Гланцмана называют клиническую картину, причиной которой является генетический дефект рецептора фибриногена и тромбоспондина (IIb/IIIa). 

Итак, самое интересное: сам первичный гемостаз. Важную роль в этом процессе играют не только гранулы тромбоцитов, но и рецепторы, расположенные на их поверхности. 

Так, например, рецептор Ib/IX способен связывать фактор Виллебранда (последний является протеином, вырабатываемым клетками эндотелия и мегакариоцитами и запасаемым в альфа-гранулах тромбоцитов; он также необходим для связи тромбоцитов с фибронектином и ламинином сосудистой стенки и для связи с субэндотелиальными коллагенами). Синдром Бернара-Сулье (BSS, геморрагическая дистрофия тромбоцитов) возникает вследствие нарушения связывания тромбоцитов из-за дефекта рецептора к фактору Виллебранда. Немаловажную роль играют и интегриновые рецепторы Ia/IIa и IIb/IIIa. Первый способствует связыванию тромбоцитов с субэндотелиальными матриксными протеинами (колллагеном и фибронектином), второй же является рецептором фибриногена и тромбоспондина (последний образуется на поверхности тромбоцитов после сокращения первичного тромба). Этот рецептор блокируется абциксимабом. Болезнь Гланцмана возникает в результате нарушения синтеза фактора IIb/IIIa мембраны тромбоцитов. Синдром Виллебранда описывает группу геморрагических диатезов, общая черта которых — нарушение функции фактора Виллебранда. Это заболевание уже было описано на Медаче — https://vk.cc/6RuxHU 

А теперь вновь обратимся к физиологии. Итак, произошло повреждение сосудистой стенки. Сперва происходит адгезия тромбоцитов к стенке за счет выработки фактора Виллебранда из поврежденного эндотелия сосуда. Он служит своего рода «мостиком» между субэндотелиальным коллагеном и рецептором Ib/IX тромбоцитов. Рецептор Ia/IIa связывает непосредственно тромбоциты и субэндотелиальный коллаген. Эти процессы запускают процесс активации тромбоцита, выход кальция из плотных гранул и АДФ из поврежденного эндотелия, а также секрецию тромбина, тромбоксана А2, PAF3 (фосфолипид лейкоцитов, активирует факторы свертывания), серотонина, фибронектина, тромбоспондина и фибриногена. 

Следующий этап: обратимая агрегация тромбоцитов. Обратимой она называется потому, что этот этап можно предотвратить c помощью ацетилсалициловой кислоты. Тромбоциты изменяют свою форму за счет взаимодействия актина и миозина, образуют псевдоподии (кальций из плотных гранул запускает этот процесс). Изменение формы тромбоцитов обеспечивает их лучшее прикрепление к стенке. Отрицательно заряженные фосфолипиды перемещаются на внешнюю поверхность мембраны, что привлекает факторы свертывания к месту повреждения сосуда. На этом этапе активируется рецептор IIb/IIIa. Он связывает фибриноген, образуя мостики между тромбоцитами и обеспечивая слияние их мембран. Весь этот процесс (адгезия и активация) сопровождается положительным механизмом обратной связи: все это время увеличивается выработка тромбоспондина, факторов роста, фибриногена, проацеклерина, антигемофилического фактора А, фибронектина, фактора Виллебранда, серотонина, кальция и АДФ. 

АДФ также имеет свой рецептор. Именно этот механизм является основой действия некоторых лекарственных веществ. Клопидогрел (Исковер, Плавикс) и тиклопидин, ингибиторы активации тромбоцитов, АДФ-зависимо тормозят рецепторы P2Y12. Клопидогрел чаще всего назначают пациентам с коронарной недостаточностью и облитерирующими артериитами, особенно после успешного стентирования. Известная вам ацетилсалициловая кислота ингибирует циклооксигеназы, о которых речь пойдет ниже, а абциксимаб, тирофибан и эптифибатид ингибируют гликопротеиновый рецептор IIb/IIIa напрямую, а не опосредованно, как это делает клопидогрел. 

Высвобождаемый тромбин связывается со специальными рецепторами на поверхности тромбоцитов, таким образом стимулирует фосфорилирование интрацеллюлярных протеинов и вместе с АДФ индуцирует высвобождение кальция из плотных гранул. Активируется кальций-зависимая фосфолипаза А2, которая стимулирует образование тромбоксана А2 из арахидоновой кислоты при участии циклооксигеназы. Образованные из эндопероксидов тромбоксаны влияют на дальнейшее изменение формы и агрегацию тромбоцитов. 

Вслед за обратимой агрегацией тромбоцитов следует необратимая. На этом этапе главную роль играет тромбоспондин альфа-гранул, который обеспечивает большую прочность фибриногеновых соединений между тромбоцитами и таким образом — ретракцию первичного белого тромба. 

Последним этапом является вазоконстрикция. На этом этапе важную роль играют серотонин, тромбоксан А2, катехоламины, АДФ из активированных тромбоцитов. Тромбоциты заполняют просвет поврежденного сосуда, что приводит к уменьшению скорости тока крови на этом участке. 

Мы уже рассмотрели частично, как фармакологически можно воздействовать на эти процессы. Но существуют и эндогенные механизмы. Так, например, NO и простациклин из соседних неповрежденных клеток эндотелия стимулируют процессы вазодилатации и ингибируют агрегацию тромбоцитов. PGI2 ингибирует высвобождение ферментов из гранул. Все эти процессы приводят к тому, что тромбоциты не могут образовывать псевдоподии и начинают хуже крепиться к сосудистой стенке. Простациклин активирует аденилатциклазу, что приводит к повышению концентрации цАМФ и обратному току ионов кальция из цитозоля в плотные гранулы, и таким образом стабилизирует сами тромбоциты. 

Время кровотечения обычно определяют, когда хотят выяснить причину геморрагического диатеза или в целом установить его наличие. Время кровотечения устанавливают in vivo по стандартизированному методу, выполняя прокол кожи на предплечье. Сперва ремешком затягивают сосуды на плече (давление около 40 мм рт. ст). Внутреннюю сторону предплечья сперва необходимо дезинфицировать. Бумажкой для фильтрации собирают кровь, при этом не задевая краёв ранки.

Время кровотечения по Ivy не должно быть больше 5–10 минут. Этот тест позволяет только проанализировать наличие патологии, но, исходя из результата, невозможно определить её причину. 

Сходный анализ можно провести также in vitro c помощью Platelet Function Analyzer (PFA). К этому способу обычно прибегают при подозрении на тромбоцитопатии, болезнь Виллебранда, а также для контроля антиагрегационной терапии (ацетилсалициловая кислота, клопидогрел или прасугрел). Для проведения данного анализа необходимы специальные PFA-моноветты, содержащие буферную систему из тринатрий лимонной кислоты (0,129 моль, pH 5,5). Такая проба способна храниться при комнатной температуре 4 часа. Анализ происходит автоматически: кровь поступает в систему капилляров, покрытую коллагеном и активатором тромбоцитов (АДФ или адреналин). Из-за контакта с системой таких мембран тромбоциты агрегируют и закупоривают собой капилляры, из-за чего ток крови прекращается и фиксируется это время. Чтобы тест показал достоверные результаты, необходимо учитывать, что показатель гематокрита должен быть более 0,35, количество тромбоцитов не меньше 80 000 в микролитре крови, а сама проба была изъята только из венозной системы. 

Производителей теста существует несколько, поэтому каждый раз необходимо уточнять о показателях нормы у производителя, но мы приведем вам средние значения: 

Норма: Коллаген+АДФ: 70–120 секунд; Коллаген+Эпинефрин: 90–170 секунд. 
Терапевтическая норма при терапии ацетилсалициловой кислотой: Коллаген+Эпинефрин: более 170 секунд. 
Терапевтическая норма при терапии Клопидогрелем при применении P2Y: более 170 секунд. 

Увеличение времени в обеих пробах (с коллагеном и АДФ, с коллагеном и эпинефрином) может быть признаком тромбоцитопатии или наличия у пациента дефекта фактора Виллебранда. Увеличение только лишь времени в случае пробы с коллагеном и эпинефрином может быть результатом терапии ацетилсалициловой кислотой, или же признаком редкой тромбоцитопатии типа аспириноподобного синдрома. 

Количество тромбоцитов при анализах крови определяют почти всегда. Их общее число играет роль в диагностике тромбоцитопении и некоторых заболеваний костного мозга. Этот показатель часто учитывают перед операциями и другими вмешательствами. Для данного теста годится как венозная, так и капиллярная кровь с примесью ЭДТА. Подсчет производится автоматически. При сильно сниженном количестве тромбоцитов (менее 10 в нанолитре) или же атипичных тромбоцитах применяют метод проточной цитометрии CD 61, или же считают вручную. В случае новорождённых количество тромбоцитов в норме составляет 100–250 в нанолитре крови, а у взрослых 150–450 в нанолитре крови. Как уже было описано в предыдущем посте, ЭДТА вызывает in vitro агрегацию тромбоцитов, которая приводит к снижению показателей количества тромбоцитов (псевдотромбоцитопения). 

— Легкая тромбоцитопения: 50–150/нл; 
— Средняя тромбоцитопения: 20–50/нл; 
— Тяжелая тромбоцитопения: < 20/нл. 

Пациенты с тромбоцитопенией средней степени тяжести склонны к спонтанным кровотечениям, что следует учитывать при планировании операций. Тромбоцитопения также может наблюдаться после цитостатической терапии. Реактивный тромбоцитоз возникает как следствие потери большого количества крови, или же может развиться при железодефицитной анемии. Эссенциальный тромбоцитоз может быть следствием заболеваний костного мозга и часто сопровождается увеличением количества тромбоцитов более 1000/нл; клинически это проявляется повышенным тромбообразованием. 

Для анализа крови при диагностике болезни Виллебранда используют кровь с добавлением цитрата. Чаще всего диагностику проводят с помощью антител ELISA. Также можно определить способность vWF связываться с коллагеном и гликопротеиновым Ib/IX-рецептором при содействии ристоцетина как кофактора. Ристоцетин является пептидом, который способен так изменить структуру фактора Виллебранда, что тот начинает активно связываться с рецептором, тем самым запуская процесс агрегации тромбоцитов. Можно использовать коллагеновый тест: коллаген фиксируют на мембране и добавляют в раствор кровь пациента, в дальнейшем определяя количество связавшегося фактора Виллебранда. 

Известно, что у людей разных групп крови количество фактора Виллебранда в плазме крови отличается. Замечено, что у первой (0) и второй (А2) групп крови этого фактора статистически меньше, чем у других групп. Тест считают положительным при определении патологии в двух друг от друга не зависящих тестах, а также при наличии у пациента клинических манифестаций. Фактор Виллебранда может быть повышен при васкулите, а также при первой фазе реакции на воспаление. 

Норма для обладателей второй (А1), третьей и четвертой групп крови: 
— VWF-Антиген: 64–150 %; 
— Ристоцетин-кофактор: 65–165 %; 
—Способность связывать коллаген: 0,65–1,3 ЕД/мл. 

Норма для обладателей первой и второй (А2) групп крови: 
— VWF-Антиген: 46–125 %; 
— Ристоцетин-кофактор: 50–130 %; 
— Способность связывать коллаген: 0,45–1,2 ЕД/мл. 

Анализ тромбоцитопатий

Главная функция всех тромбоцитов — образование тромба. Тромбоциты активируются при контакте с АДФ, коллагеном, арахидоновой кислотой, эпинефрином (адреналином), TRAP (белком, активирующим рецептор тромбина) и ристоцетином. С помощью фотооптических методов исследуют прохождение света через анализатор. При большом количестве тромбоцитов и факторов гемостаза тромб образуется быстрее, следовательно, меньше света пропускает сама проба. Другим методом является импедансная агрегометрия, при которой на двух электродах измеряется электрическое сопротивление, которое изменяется в зависимости от скорости агрегации тромбоцитов. Последний способ можно проводить, даже не центрифугируя пробу. 

Напоследок поговорим об иммунотромбоцитопении. При этом исследовании используют цельную кровь с примесью ЭДТА или цитрата с целью определить связанные антитромбоцитарные антитела. Исследуют и сыворотку крови, если требуется определить наличие свободных антитромбоцитарных антител. Тромбоциты изолируют, а затем определяют наличие антител. Однако отрицательный результат теста не исключает наличие у пациента заболевания, поскольку для данной болезни является характерным колебание титра антител. 

Источники: 

1. Schmidt R. F., Thews G. (ed.). Physiologie des Menschen. – Springer-Verlag, 2013. 

2. Dörner K. Klinische Chemie und Hämatologie: 69 Tabellen;[Taschenlehrbuch]. – Georg Thieme Verlag, 2013.