Предпосылки

Применение молекулярных способов исследования метаболизма физических упражнений на протяжении последних нескольких десятилетий обеспечило лучшее понимание множественности, сложности и «перекрестной связи» между многочисленными клеточными сетями, вовлеченными в различные ответные реакции при упражнениях. В эти годы учёными также была подробно исследована роль доступности питательных веществ в управлении адаптацией к тренировке и повышении работоспособности. Тем не менее, многие ключевые открытия последней половины века, заложившие основы молекулярного синтеза, опираются на результаты исследований, проведенных в конце XIX и начале XX вв. В это время в университетах Европы и Северной Америки, используя разнообразные манипуляции с упражнениями и диетой было проведено множество исследований с целью ответить на вопросы: «какие субстраты утилизируются сокращающимися скелетными мышцами во время упражнений» и «что ограничивает способность к упражнениям?» Пионеры в этой области, работая в лабораториях, ставшими центрами исследований мышечного метаболизма, провели в этот период многие «классические» исследования,обозначили новые научные вопросы и разработали инновационные техники для будущих поколений. Этот краткий исторический синопсис описывает, как несколько крупных открытий прошлого века повлияли на современные знания о мышечном метаболизме во время упражнений.

Ранние годы

В настоящее время принято считать, что субстратом, поддерживающим сокращение скелетных мышц при упражнениях длинной более нескольких минут, являются внутри- и внемышечные углеводы и липиды, а также в значительно меньшей степени аминокислоты. Кроме того, ученые согласны в том, что главными детерминантами баланса углеводов (мышечного и печеночного гликогена и глюкозы крови, полученной из поглощенных углеводов и путем глюконеогенеза) и липидов (триглицериды мышц и жировой ткани, а также свободные жирные кислоты и триглицериды крови) для активных мышц являются относительная интенсивность упражнений (выраженная в доле максимального количества кислорода, поглощаемого индивидуумом ) (Romijn et al., 1993; van Loon et al., 2001) и характером диеты в предшествующие дни (Bergström et al., 1967). Но так было не всегда! Последние годы 19го века и первые десятилетия 20го века ознаменовали себя оживленными спорами касательно относительной эффективности углеводов, жиров и белков в качестве источников энергии для мышечной активности. В основном полагали, что углеводы являются единственным субстратом, который может быть использован для питания сокращающихся мышц, и что жиры сначала должны трансформироваться в углеводы, а уже затем окисляться как источник энергии со значительными затратами энергии в процессе. Тем не менее, Natan Zuntz (Zuntz 1896, 1901) и его коллеги (Frentzel and Reach, 1901) были уверены, что как жиры, так и углеводы могут быть использованы в качестве источников энергии и показали, что изменение пропорций жиров и углеводов в диете в предшествующие дни приводило к соответствующим изменениям соотношения небелкового респираторного обмена (НРО: количество поглощаемого кислорода /количество выделяемого углекислого газа ) во время последующих упражнений. Они также показали повышенное потребление кислорода при физической активности (~12%) в случаях, когда жир был основным окисляемым субстратом. В последующие десятилетия многие ученые участвовали в дискуссии относительно источников субстрата для мышечной активности, но долгое время никто не мог прийти к однозначному ответу. Отчасти это было связано с ограничениями существующих методик, которые не позволяли точно измерять внешнюю работу во время упражнения или проводить точное количественное измерение убыли субстрата. Оценка количества окисляемых жиров и углеводов целиком и полностью основывались на измерении VO2 и VCO2 на уровне легких при помощи громоздких и неточных методик анализа состава выдыхаемого воздуха. Выделение азота с мочой использовалось в качестве индекса катаболизма белков. August Krogh внес значительный вклад в эту область, в том числе разработав надежный электрический велоэргометр, который позволял осуществлять точный контроль внешней работы (Krogh, 1913). Он также усовершенствовал существующие методы анализа кислорода и углекислого газа, разработав химический анализатор, позволяющий определять концентрации этих газов в выдыхаемом воздухе с точностью до 0,001% (Krogh, 1920). Стоит отметить, что точность этих методов значительно превышает мощность электронных анализаторов, используемых в большинстве современных лабораторий, изучающих физиологию упражнений (рис. 1). Рис.1. Некоторые методологические прорывы очень сильно помогли нам в понимании метаболизма упражнений.
Август Крог (August Krogh) рядом с им же разработанным аппаратом для точного измерения концентраций газов в выдыхаемом воздухе. Используя эти новые методы, Krogh и Lindhard (1920) провели ряд исследований (хотя и на малом количестве испытуемых) касательно влияния состава диеты на использование субстратов в мышцах. Они подтвердили результаты Zuntz и его коллег (Frentzel and Reach, 1901; Zuntz 1896, 1901), показав, что соотношение окисляемых жиров и углеводов во время аэробных тренировок (упражнений, при которых скорость окисления субстратов соответствует количеству доступного кислорода) различалось в зависимости от предшествующей диеты, и что потребление кислорода при упражнениях было на 11% меньше при использовании углеводов, а не жиров. Исследователи считали, что потребление белков в окислительном метаболизме было мало, но, на основании повышенного выделения азота с мочой, Cathcart (1925) предположил, что вклад белков в общий метаболизм повышается во время «очень продолжительных» или интенсивных упражнений. Даже в 1924 году A. V. Hill думал, что необходимо превращение жиров в углеводы перед окислением и ссылался на большее потребление кислорода при использовании жировых субстратов в качестве обоснования своей позиции (Hill, 1924). Эти выводы оставались спорными, до тех пор пока Reynolds et al. (1927) не сообщили об отсутствии разницы в механической эффективности во время упражнений при разных диетах. На протяжении своей знаменитой карьеры, Krogh совершил несколько путешествий и установил связи, помимо всех остальных, с Гарвардской Лабораторией Усталости (Harvard Fatigue Laboratory) в Бостоне. Первым и единственным научным руководителем лаборатории был Dr. David Bruce Dill, который являлся движущей силой для множества научных достижений лаборатории. Его группа проводила собственные исследования метаболизма упражнений и ограничения рабочей способности (Dill et al., 1932) и в то же время сотрудничала с большим количеством ученых по всему миру. В 1922 году, Hill получил Нобелевскую Премию Физиологии и Медицине за свою работу о теплопродукции в сокращающихся мышцах и ему хотелось согласовать физические процессы, возникающие при мышечном сокращении, с преобладающей метаболической активностью. Английская школа биохимиков под предводительством Fletcher и Hopkins уже установила важность образования молочной кислоты во время сокращения мышц у амфибий в анаэробных условиях и сопутствующее подавление образования лактата в присутствии кислорода (Fletcher, 1907). Позже было доказано, что лактат образуется из мышечного гликогена. Otto Meyerhof и Hill разделили Нобелевскую Премию 1922 года за открытие обратного превращения лактата, образованного во время интенсивной тренировки, в гликоген, а также его превращение в CO2 и H2O во время восстановления после тренировки. Hill также поднял актуальный до сих пор вопрос о том, ограничена ли способность к тренировке поступлением кислорода в работающие мышцы или метаболическими реакциями, происходящими в в мышце. В 1923 году, Hill и Meyerhof предположили, что энергия, необходимая для сокращающейся мышцы, может быть получена анаэробным или аэробным метаболическими путями (Hill and Meyerhof, 1923). Embden и другие ученые впоследствии заполнили недостающие части картины метаболических путей, вовлеченных в метаболизм углеводов, но большая часть этих работ была прервана и отложена в силу определенной напряженности в Европе в то время. В конце 1920х в мышцах также было обнаружен высокоэнергетический фосфат («фосфаген»), который определили как креатин фосфат (Eggleton and Eggleton 1927; Fiske and Subbarow 1927). Креатин фосфат рассматривали как немедленный источник энергии для активных мышц, но в более поздних исследованиях было обнаружено, что фосфаген был не единственным подобным соединением. В самом деле, только в 1962 году Cain и Davies (1962) доказали, что немедленным источником энергии является аденозинтрифосфат (АТФ, ATP). Тем временем в Копенгагене, Erik Hohwü Christensen закончил свои докторские исследования с Krogh и Lindhard касательно физиологической реакции на тяжелые упражнения. Вместе с Erligh Asmussen и Marius Nielsen, Christensen внес вклад в достаточно продуктивный период исследований мышечного метаболизма. С Ole Hansen он провел ряд исследований, показывающих важность доступности углеводов для физической работоспособности и влияние интенсивности и длительности упражнений на мышечный метаболизм. Как и сегодня, некоторые ранние исследователи были заинтересованы в управлении физической работоспособностью, в то время как другие рассматривали упражнения исключительно как еще один инструмент, с помощью которого можно было изучать физиологию и метаболизм. Работа Christensen и Hansen (1939a, 1939b), которая показала, что манипуляции с содержанием углеводов в предшествующей диете повлияли на время, в течение которого испытуемые были способны поддерживать работу с определенной мощностью, предсказуемо следовала из более ранних работ Krogh и Lindhard, которые сообщили, что субъекты справлялись с субмаксимальными задачами легче после нескольких дней диеты с высоким содержанием углеводов, чем при предшествующей диете с низким содержанием углеводов и высоким содержанием жиров. Тем не менее, исследования Christensen и Hansen (1939a, 1939b) в настоящее время широко признаны как ключевые исследования, вероятно, благодаря их практическому применению. В начале 1940х, Christensen переехал в Стокгольм и был руководителем докторов Per-Olof Astrand и Bengt Saltin, которые стали пионерами в области упражнений и физиологии мышц.  

“Классический” период биохимии упражнений: 1960­-1985.

25 лет с 1960 года по середину 80­х, называют “классическим” периодом биохимии упражнений (Brooks and Mercier 1994). Именно в этом периоде произошли значительные прорывы в понимании того, как физические упражнения способствуют биосинтезу митохондриальных белков в скелетных мышцах, а также влияния тренировок и диеты на накопление энергетических субстратов и выносливости, метаболизм молочной кислоты во время тренировок и восстановления, регуляцию белкового баланса. Результаты многочисленных исследований, проливших свет на механизмы мышечной регуляции, были получены благодаря новым подходам к старым вопросам и/или применению устоявшихся методов из других областей к изучению мышечного метаболизма. В начале 1960­х было мало известно о факторах, регулирующих биогенез митохондрий в скелетных мышцах. Плодотворные работы доктора John Holloszy (Holloszy, 1967)  возвестили важные подвижки в разъяснении клеточных явлений, контролирующих биоэнергетику мышц, когда он открыл, что мышцы тренированных крыс содержат большее количество митохондриальных белков, чем мышцы нетренированных. Используя энергичные упражнения на беговой дорожке, включающие продолжительный бег и интервальный спринт, Holloszy (1967) показал, что митохондрии мышц тренированных крыс показывают больший уровень дыхательного контроля и тесное сопряжение окисления и фосфорилирования. Увеличение пропускной способности цепи переноса электронов было связано с соответствующим повышением способности производить АТФ и Holloszy (1967) заключил,что эта адаптация “может частично объяснить увеличение аэробной работоспособности, происходящее после длительных, регулярно выполняемых упражнений”. Использование техники чрескожной биопсии для получения небольших (100-­200 мг) образцов мышц позволило относительно легко проводить инвазивные исследования мышечного метаболизма и определять влияние тренировок, диеты и других манипуляций на конкретные биохимические (Holloszy and Booth 1976), метаболические (Saltin 1973), гистологические (Gollnick et al., 1972) и сократительные (Saltin et al., 1977) характеристики. Примерно в это же время, Goldstein (1961) предположил, что существует некий ''гуморальный фактор'', высвобождаемый мышцами во время сокращения, и что он ''активирует транспортную систему глюкозы'' , а также помогает ''регулировать углеводный обмен''. В попытке выяснить, может ли системный “гуморальный” фактор или локальный фактор в мышечных клетках объяснить быстрый посттренировочный ресинтез мышечного гликогена, двое шведских ученых, Drs. Jonas Bergstro¨ m и Eric Hultman (рис. 2), предприняли оригинальное исследование включавшее несколько дней манипуляций упражнениями и диетой, в котором (в соответствии со скандинавской традицией) они сами участвовали в качестве единственных подопытных  (Bergstro¨m and Hultman, 1966). В первый день их эксперимента, исследователи сели с разных сторон велоэргометра, и каждый крутил педали одной ногой, пока другая отдыхала. Упражнение продолжалось до полного утомления, после чего они взяли друг у друга биопсии с обеих ног. Весь остальной день и в течение следующих 2 дней, Bergstro¨ m и Hultman потребляли высокоуглеводную пищу и брали биопсии, снова с обеих ног, утром второго и третьего дня. Так они выяснили, что содержание гликогена в тренируемой ноге сразу после упражнения было очень низким, в то время как другая нога содержала нормальные запасы гликогена. После 1 дня высокоуглеводной диеты, содержание гликогена в тренируемой ноге возросло практически с нуля до более высоких значений, чем в отдыхающей ноге, и продолжало расти в течение последующих 2 дней диеты, так, что значения были в 2 раза выше, чем в нетренируемой ноге на 3­й день (рис. 3). Bergstro¨ m и Hultman (1966) пришли к выводу, что индуцированное физическими упражнениями истощение гликогена усилило его ресинтез и этот ''постоянный эффект усиления'' был ''локализован в мышечных клетках'' неизвестными факторами. С замечательной проницательностью, они также предположили, что '' некоторые из полезных эффектов физических упражнений у здоровых, а также больных диабетом (людей) могут быть опосредованы этим фактором''. Результаты этого исследования заложили основы для будущей работы по изучению регуляции метаболизма мышечного субстрата во время тренировки, проведенной скандинавскими учеными (в том числе Drs. Bengt Saltin и Lars Hermansen) и их сотрудниками (в том числе Drs. Phillip Gollnick и David Costill из США) в последующие два десятилетия. Рис.2. Первопроходцы в области метаболизма.
Доктора Jonas Bergstrom и Eric Hultman представили технику перкутанной биопсией иглой для изучения метаболизма мышц человека и и были единственными авторами в их эпохальной статье, опубликованной в 1966 году, в которой они исследовали взаимодействия между физическими упражнениями и диетами на ресинтеза мышечного гликогена. Рис.3. Эффект взаимодействия между предварительной физиологической адаптацией (разминочные упражнения) и Карбогидрат-богатой диеты на ресинтез мышечного гликогена. Содержание мышечного гликогена в ногах в состоянии покоя (пунктирная линия) и во время упражнений (жирная линия. Биопсии были взяты из обеих ног двух подопытных в то же самое время при каждом отборе проб. Взято из Bergstrom and Hultman (1966). Синтез мышечного гликогена после упражнений: усиливающий фактор локализован в мышечных клетках человека. В то же время, результаты исследований с использованием меченой глюкозы и жирных кислот наряду с прямыми измерениями их потребления тренируемыми конечностями (Hagenfeldt and Wahren, 1966; Havel et al., 1967; Wahren et al., 1971) показали, что сокращающиеся скелетные мышцы могут использовать эти вещества непосредственно из крови во время упражнения. Также были исследованы роль доступности субстрата в определении взаимодействия использования жиров и углеводов в течение упражнения и роль пищевых манипуляций в улучшении физической выносливости (Pernow and Saltin, 1971). Dr. George Brooks рассмотрел различные аспекты метаболизма лактата во время тренировки и определил лактат как важный метаболит, используемый во время упражнения, в функционировании цикла Кори (Brooks, 1986). Henrik Galbo, работая в Институте Panum в Копенгагене, изучал влияние доступности субстрата на гормональный ответ после длительных тренировок, в то же время совершив многочисленные исследования эндокринного ответа и адаптаций к тренировкам. Еще с начала 1900­х годов было известно, что физические упражнения могут потенцировать действие инсулина  (Lawrence, 1926)  и исследования в 1970 и 1980 подтверждают значение ''местных факторов'' внутри сокращающихся скелетных мышц в проведении этого эффекта (Richter et al., 1989; Wallberg-Henriksson and Holloszy 1984). Также стало известно, что скелетные мышцы могут выделять биологически активные молекулы, так называемые “миокины” и что они ''перекрестно воздействуют'' на другие органы (в том числе жировую ткань, печень, поджелудочную железу, кости и мозг), что объясняло механизм реализации благотворных системных эффектов тренировок. Использование меченых индикаторов как метаболических зондов для изучения метаболизма всего тела и конечностей способствовало значительному прогрессу в нашем понимании кинетики энергетического субстрата во время тренировки и последующего восстановления. Ранние исследования в 1960 изучали потоки глюкозы (Reichard et al., 1961; Sanders et al., 1964) и жирных кислот  (Havel et al., 1963, 1967)  с использованием меченных радиоактивными изотопами молекул глюкозы и пальмитиновой кислоты и показали, что физические упражнения увеличили оборот обоих энергетических субстратов. Позже, применение стабильных изотопов самостоятельно, либо в сочетании с радиоактивными, позволило исследовать обмен углеводов, жиров, и белков во время и после тренировки (Chesley et al., 1992; Rennie et al., 1981; Romijn et al., 1993; van Loon et al., 2001), эффекты тренировок на потоки субстрата (Coggan et al., 1995; Friedlander et al., 1997, 1998), а также влияние изменения питания на обмен веществ во время тренировки (Bosch et al., 1993) и послетренировочный баланс субстрата. Много внимания было уделено влиянию физических упражнений и перорально вводимых углеводов/аминокислот на кинетику глюкозы мышц, синтез гликогена в мышцах и синтез белков после упражнений, что позволило заложить основы современного понимания реакции мышечного метаболизма на упражнения и питание (рис. 3).

Начало молекулярного периода

Расшифровка химической структуры ДНК наряду с выдающимися достижениями в молекулярной биологии и смежных аналитических технологиях за последние 50 лет позволили лучше понять клеточные и молекулярные механизмы, которые регулируют метаболизм в мышцах во время физических нагрузок, а также адаптацию мышц к тренировкам. Молекулярные основы адаптации скелетной мускулатуры к тренировкам (повышение количества митохондрий, изменение обмена веществ, усиление ангиогенеза и гипертрофия мышечных волокон) в своей основе имеют повышение экспрессии и/или активности ключевых протеинов, которые являются посредниками во множестве реакций: пре- и посттранскрипционных процессах, регуляции трансляции и экспрессии белков, изменении активности и внутриклеточной локализации белков. Существует множество сигналов, ассоциированных с физическими нагрузками, повышающими выносливость. На разные сигналы реагируют различные киназы, имеющие множество нисходящих путей и целей (Egan and Zierath 2013; Coffey and Hawley 2007). Это комплекс временных и пространственных взаимодействий между различными элементами, направленный на создание комплексного ответа на физические нагрузки и достижение конечного результата в виде функционального улучшения и изменения фенотипа. (Hawley et al., 2014). В течение последнего десятилетия развивалась концепция, что ответ на физические нагрузки отражает суммарную реакцию на повторяющиеся единичные физические упражнения (Perry et al., 2010). Быстрые и кратковременные изменения в транскрипции генов в ответ на единичные физические упражнения закрепляются повторением физических нагрузок, что формирует основы адаптации скелетной мускулатуры к тренировкам и улучшает переносимость физических нагрузок и физическую работоспособность (Hawley 2002). Таким образом, отсутствие регулярных физических тренировок в течение “безтренировочного” периода приводит к быстрой реверсии адаптационных изменений (Coyle et al., 1984). Повышение окислительной способности скелетной мускулатуры и связанное с этим изменение обмена веществ являются показателем устойчивой адаптации к физическим нагрузкам. Регуляция митохондриального биогенеза включает взаимодействие между ядерным и митохондриальным геномами, синтез липидов и протеинов и стехиометрическую сборку многокомпонентных белковых комплексов в функционирующую дыхательную цепь (Hood et al., 2006). Williams и его коллеги в 1986 г. были одними из первых, кто исследовал молекулярные основы адаптации. Они наблюдали повышение концентрации цитохрома с, мРНК и митохондриальной ДНК в ответ на хроническую электрическую стимуляцию передней большеберцовой мышцы у кроликов. Регуляция на уровне транскрипции была подтверждена после обнаружения кратковременного повышения транскрипции генов, кодирующих GLUT 4 и цитратсинтазу в скелетной мускулатуре крыс в ответ на единичные физические нагрузки (Neufer and Dohm, 1993). Впоследствии несколько независимых групп наблюдали кратковременное повышение в скелетной мускулатуре человека уровня мРНК отдельных метаболических генов, транскрипционных факторов и коактиваторов в ответ на единичные физические нагрузки (Kraniou et al., 2000; Pilegaard et al., 2000, 2003; Russell et al., 2005). В 1996 г. было установлено, что АМФ-активируемая протеинкиназа (АМФК) активируется при физических нагрузках и вовлекается в процесс окисления жирных кислот (Winder and Hardie, 1996). Дальнейшие работы демонстрируют, что АМФК участвует во многих ответных реакциях на физическую нагрузку, изменяя энергетический статус клетки за счет того, что ингибирует АТФ-зависимые пути и активирует пути, использующие углеводы и жирные кислоты, восстанавливая тем самым концентрацию АТФ в мышце. В то же время АМФК участвует в адаптации скелетной мускулатуры к длительным тренировкам, поскольку она способна изменять запас питательных веществ в мышцах и экспрессию некоторых генов, отвечающих за реакцию на физические нагрузки (Frøsig et al., 2004; McGee and Hargreaves, 2010). Важным событием в понимании механизмов активации митохондриального биогенеза стало открытие транскрипционного коактиватора PGC-1α (коактиватор рецептора γ, активируемого пролифераторами пероксисом, 1α) лабораторией Speigelman lab (Wu et al., 1999). Поскольку PGC-1 коактиваторы универсальны и взаимодействуют с множеством различных транскрипционных факторов, активируя многие биологические программы в разных тканях, они привлекают значительное внимание в качестве потенциальных посредников в формировании изменений в митохондриальном биогенезе и ангиогенезе скелетных мышц под действием физических тренировок (Lin et al., 2005; Yan et al., 2011). Таким образом, важно отметить избыточность и взаимозаменяемость механизмов, регулирующих мышечный метаболизм (McGee et al., 2014; Yan et al., 2011), из чего следует, что множественные механизмы регуляции создают фундамент адаптации к единичным и постоянным тренировкам. Оказывая эффект на транскрипцию генов и транскриптом, тренировки обычно не вносят существенных изменений в структуру генов. Изменения затрагивают эпигенетическую модификацию ДНК и связных с хромосомами белков (Rasmussen et al., 2014). Эпигенетические модификации являются связующим звеном между изменениями в окружающей среде (тренировки, уровень физической активности) и перестройкой экспрессии и функционирования генов. Двумя главными механизмами эпигенетической модификации являются метилирование ДНК и посттрансляционные модификации гистонов, включающие ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и убиквинтинирование. Изменение транскрипции генов некодирующих РНК, в том числе микроРНК, является еще одной формой эпигенетической модификации. Играя все большую роль, исследование генома дает потенциальную возможность найти «гены тренировок и выносливости», что даст биологам возможность понять многие аспекты процессов адаптации к тренировкам, в том числе биологические основы индивидуальной реакции на них. Эти выдающиеся открытия в молекулярной и клеточной биологии, а также в области аналитических технологий, позволили лучше понять основы адаптации скелетной мускулатуры к единичным и постоянным физическим нагрузкам. В статье наших коллег Zierath и Wallberg-Henriksson (2015) приводятся рассуждения о будущем биологии упражнений. Тем не менее, сколько бы мы ни продвигались вперед, не следует забывать первые труды выдающихся ученых 19-го и 20-го столетий, заложивших крепкий фундамент современных знаний в этой области.

Оригинал статьи