Микробиом роговицы в норме и при патологии
Автор: old.medach.pro
Поверхность нашего глаза не стерильна. В действительности в этом нет ничего удивительного, ведь бактерии обитают в нашем организме практически повсеместно. Было бы довольно странно, если такой контактирующий с окружающей средой орган, как глаз, оставался бы без микроорганизмов. Разумеется, этого не происходит. На поверхности глаза обитает значительное количество бактерий, многим из которых даже еще не было дано научного названия. Помимо своего более-менее мирного сосуществования, даже условно-патогенная флора способна вызывать множество заболеваний переднего отрезка глаза, в том числе и бактериальные кератиты. Кроме того, изменения в макроорганзиме, будь то травмы или системные заболевания, обязательно влияют на состав микрофлоры глаза. Все это говорит о том, что даже в таком небольшом органе, как глаз, микрофлора играет очень важную роль.

Кто живет на поверхности?

Донг и коллеги провели исследование микробиома роговицы у здоровых добровольцев. Чтобы определить точное количество типов и родов, они применили метод метагеномного секвенирования полученных образцов.  Результаты поистине поразили ученых. Мало того, что исследование выявило огромное количество ранее неизвестных бактерий, так еще и были найдены в большом количестве такие патогенные бактерии, как представители рода Pseudomonas.  Не вызывая никаких заболеваний, они являлись явным большинством среди обитателей поверхности глаза. untitled-graphic bacteria-2 (2)

"Ядро" микробиома в норме

Источник: Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Jul 20;52(8):5408-13. doi: 10.1167/iovs.10-6939. Источник: Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Jul 20;52(8):5408-13. doi: 10.1167/iovs.10-6939. Genuslevel представляет 12 наиболее распространенных родов бактерий у четырех обследуемых, которые были подсчитаны в соответствии с распределением относительного множества интерпретированной ДНК. Процент прочитанной ДНК, который не позволил классифицировать бактерии обозначается как "прочие" ("other"). Условные обозначение цветной маркировкой на правой стороне панели определены для каждого рода. И все же, несмотря на такие ошеломляющие результаты, Донг и коллеги смогли выделить наиболее распространенные роды микробов, ими оказались:
  • Pseudomonas (20%)
  • Propionibacterium (20%)
  • Bradyrhizobium (16%)
  • Corynebacteria (15%)
  • Acinetobacter (12%)
  • Brevundimonas (5%)
  • Staphylococcus (4%)
  • Aquabacterium (2%)
  • Sphingomonas (1%)
  • Streptococcus (1%)
Из них Pseudomonas, Acinetobacter, Propionibacterium, Corynebacterium, Staphylococcus, Streptococcus, и Sphingomonas часто  вызывают воспалительные заболевания, в том числе и кератиты.

Как бактерии влияют на глаза?

Комменсалы и оппортунисты

Pseudomonas aerugenosa. Источник: http://old.fineartamerica.com/featured/1-pseudomonas-aeruginosa-bacteria-sem-steve-gschmeissner.html Pseudomonas aerugenosa. Источник: http://old.fineartamerica.com/featured/1-pseudomonas-aeruginosa-bacteria-sem-steve-gschmeissner.html Нормальная микрофлора глаза человека делится на два типа: комменсалы и оппортунисты. Комменсалы просто существуют, без какого-либо вреда, тогда как оппортунисты иначе называются условно-патогенной флорой. Условно, потому что при снижении иммунитета, травме или каких-либо еще состояниях ранее мирно сосуществовавшие микробы начинают атаковать ткани человека, вызывая инфекционные заболевания. Среди оппортунистов выделяют уже названные ранее роды бактерий Pseudomonas, Acinetobacter, Propionibacterium, Corynebacterium, Staphylococcus, Streptococcus, и Sphingomonas, а также менее распространенные, но встречающиеся — Gordoni, Kocuria, Pantoea, Oligella, Ralstonia и  Delftia. Предположительно, микробы-комменсалы эволюционировали вместе с людьми. Это означает, что им приходилось "обучать" иммунную систему во время ее созревания, индуцируя "толерогенные" дендритные клетки и "ослабляя" активность макрофагов, чтобы они не влияли на процесс колонизации поверхностей организма. Именно так происходило с кишечником человека. Несмотря на то, что на молекулярном уровне, эти взаимодействия между микробиотой и хозяином, остаются неисследованными, замечено, что в этом участвуют паттерн-распознающие рецепторы. Патологические сдвиги  в составе местной микрофлоры приводят к серьезной гиперстимуляции этих рецепторов (toll-like рецепторы) в аллергизированных тканях, например, на конъюнктиве у пациентов с приобретенным кератоконъюнктивитом.

Колониальная резистентность

Несмотря на то, что колониальная резистентность микрофлоры глаза не изучена, можно предположить, что здесь (аналогично микробиому кишечника) работает правило: местная флора не дает размножаться чужеродным бактериям.

Тренировка иммунной системы

Нормальная микрофлора глаза позволяет поддерживать иммунную защиту на должном уровне, стимулируя intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1)-зависимый рекрутинг CD4(+) T cells опосредованный interleukin-17 (IL-17) рецепторами и выработкой IL-22.

Разрушение муцина

Муцин в составе прекорнеальной слезной пленки подавляет рост микрофлоры, являясь, таким образом, фактором регуляции численности микроорганизмов. Бактерии-комменсалы обладают муколитической активностью, поэтому при увеличении своей численности, они способны нивелировать действие муцина.  

Пришельцы

Mycobacterium tuberculosis. Источник: cellbiology.med.unsw.edu.au Mycobacterium tuberculosis. Источник: cellbiology.med.unsw.edu.au К патогенным бактериям, попадающим из внешней среды и вызывающих инфекционные заболевания относят :
  • Семейство Enterobacteriaceae (включая Klebsiella, Enterobacter, Serratia и Proteus)
  • Род  Mycobacterium ( включая M.tuberculosusM.abscessus и M.leprae)
  • Спирохеты (Leptospira interrogans и Treponema pallidum) 
  • Вид Brucella melitensis
  • Род Neisseria (N.gonorrhoeae,N.meningitidis)

Бактериальные кератиты

Бактериальный кератит Бактериальный кератит Бактериальная микрофлора способна вызывать кератиты, инфекционное заболевание заболевание роговицы , которое проявляется  преимущественно её помутнением, изъязвлением, болью и покраснением глаза. Причиной такого заболевания служит как правило резидентная оппортунистическая микрофлора, изменяющая свою вирулентность под воздействием внешних факторов . Грозным осложнением бактериального кератита является язва роговицы, приводящая ко множеству неблагоприятных последствий, в том числе и к слепоте. По распространенности, бактериальный кератит варьирует от 11 на 100.000 человек в США и 799 на 100.000 человек в Непале. . Такой разброс свидетельствует о том, что на частоту встречаемости этого заболевания влияют социально-экономические факторы, но несмотря на снижение числа заболевающих в развитых странах, бактериальные кератиты остаются важной проблемой общественного здоровья.

Вторжение!

Для того, чтобы успешно произвести атаку на ткани роговицы, бактерии используют ряд эволюционных приспособлений:

Факторы патогенности

Адгезины

Обеспечивают прикрепление бактерии к поверхности.

Инвазины

Поверхностные белки, которые реорганизуют актиновые филаменты, позволяя бактерии проникать в глубь тканей.  После проникновения, бактерии вновь могут использовать актиновые филаменты для движения.

Импедины

Эти вещества не дают иммунным клеткам организма хозяина запоминать информацию о патогенных свойствах бактерии.

Агрессины

Гипотетические соединения, усиливающие вирулентность бактерии. Предполагается, что они парализуют защитные механизмы организма-хозяина, что приводит к повреждению тканей и усилению воспаления.

Модулины

Способствуют выбросу цитокинов, влияют на активность иммунных клеток.

Антибиотикорезистентность

Устойчивость бактерий к действию антибиотиков стала проблемой здравооханения мирового масштаба. Разработка новых антибактериальных препаратов, неосторожное и нерациональное использование вкупе с непреднамеренной селекцией в ходе терапевтического применения более не маскируют (не компенсируют/не сглаживают) увеличение резистентности. Судя по всему, эта проблема решается разработкой или открытием новых антибиотиков, но этот процесс сопровождается появлением новых механизмов устойчивости, которые сложно контролировать. Инфекции, вызванные бактериями, устойчивыми к нескольким антибиотикам, характеризуются высокими показателями заболеваемости и смертности, что обусловливает высокую сложность и стоимость лечения. Селективное давление играет большую роль в появлении устойчивых к антибиотикам линий и усугубляется отпуском антибиотиков без рецепта, формализованностью терапевтического применения, повсеместным использованием антибактериальных препаратов для лечения пациентов с иммунодефицитным состоянием и пациентов отделений интенсивной терапии, использованием неадекватных дозировок препарата или недостаточной длительностью антимикробной терапии и неосторожным применением без установления чувствительности к антибиотикам изолированных микроорганизмов. Согласно теории Дарвина, реакцию на селективное давление осуществляет не индивидуальный организм, не жизнь или природа в целом, но сама популяция, это означает, что когда курс лечения ведётся неправильно, уничтожаются только слабые, уязвимые организмы, что в краткосрочной перспективе уменьшит бактериальную нагрузку и, следовательно, симптомы инфекции, но приведёт к развитию из немногих выживших бактерий поколения устойчивых линий микроорганизнов. image1 Atzin Robles-Contreras, Hector Javier Perez-Cano, Alejandro Babayan-Sosa and Oscar Baca-Lozada Bacterial Keratitis Infection: A Battle Between Virulence Factors and the Immune Response (A) Совокупность чувствительных и устойчивых к антибиотику бактерий (B) Устойчивые бактерии (C) Пролиферация устойчивых клеток

Природная резистентность

Некоторые виды бактерий, вызывающие кератиты, обладают изначально антибиотикорезистентностью. Pseudomonas aeurugenosa защищена от действия бензилпенициллинов, сульфаметоксазола + триметоприма (бисептол); Proteus mirabilis защищен от тетрациклинов и колистина; Аэробные Грам(-) бациллы защищены от действия клиндамицина; Klebsiella pneumoniae обладает защитой от пенициллинов (ампициллин, амоксициллин).

Приобретенная резистентность

  У бактерий имеются механизмы, с помощью которых они противостоят губительному действую антибиотиков:
  • Инактивация антибиотика путем изменения или разрушения его молекулярной структуры
  • Изменение мишеней, на которые воздействует антибиотик
  • Уменьшение проницаемости клеточной стенки
  • Удаление антибиотика из микробной клетки с помощью эффлюкс-системы.

Биопленка

Биопленка. Источник: Wikimedia Биопленка. Источник: Wikimedia Обычно бактерии находятся в "свободном плавании", подобно планктону, но для того, чтобы спешно колонизировать какие-либо поверхности, они начинают объединяться в сложные сообщества. Такой конгломерат из бактерий и межклеточного матрикса называют биопленкой. Источник: wikipedia Источник: wikipedia Выделяют пять стадий развития биоплёнки (текст из Wikipedia):
  1. Сначала происходит первичное прикрепление микроорганизмов к поверхности (адгезия, сорбция) из окружающей среды (обычно жидкости). Эта стадия обратима.
  2. Окончательное (необратимое) прикрепление, иначе называемое фиксацией. На этой стадии микробы выделяют внеклеточные полимеры, обеспечивающие прочную адгезию.
  3. Созревание (в англоязычной литературе — созревание-I). Клетки, прикрепившиеся к поверхности, облегчают прикрепление последующих клеток, внеклеточный матрикс удерживает вместе всю колонию. Накапливаются питательные вещества, клетки начинают делиться.
  4. Рост (в англоязычной литературе — созревание-II). Образована зрелая биоплёнка, и теперь она изменяет свой размер и форму. Внеклеточный матрикс служит защитой клеток от внешних угроз.
  5. Дисперсия (выброс бактерий): в результате деления периодически от биоплёнки отрываются отдельные клетки, способные через некоторое время прикрепиться к поверхности и образовать новую колонию.

Биопленка в патогенезе бактериальных кератитов

Роговица не самое лучше место для образования биопленки. Постоянные моргания, движение перикорнеальной слезной пленки, антимикробное действие муцина, иммуноглобулинов и перксидазы, все это затрудняет образование такого соединения. Биопленка если и образуется, то только на небольших участках поверхности роговицы. . Другое дело контактные линзы, а также инородные тела, в том числе и хирургического происхождения . Организованное микробное сообщество существенно осложняет течение заболевания и именно благодаря биопленкам стали так распространены кератиты, связанные с контактными линзами. .

Статистика по микробам, вызывающим кератиты

Грам-положительные изоляты 7-70%

Грам-положительные кокки

  • Коагулазо-негативные стафилококки (S. epidermidis the most common) 14 - 64%
  • MRCNS 10 - 60%
  • Staphylococcus aureus 12 - 29%
  • MRSA 1 -- 50%
  • Streptococcus pneumoniae 1 --35%
  • Streptococcus viridians 1 - 10%

Грамположительные бациллы

  • Род Corynebacterium 2 - 20%
  • Род Propionibacterium 2 - 7%
  • Род Mycobacterium  0 -3%

Грамотрицательные бациллы

  • Семейство Enterobacteriaceae и прочие 1 - 12%
  • Serratia marcescens 2 - 14%
  • Род Moraxella 1 - 5%
  • Pseudomonas aeruginosa 3 -- 59%
  • Nonenterobacteriaceae (Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia) 1 - 2%

Грамотрицательные коккобактерии

Род Haemophilus (H. influenzae чаще всего) 1 - 2.5%

Грамотрицательные кокки

  • Neisseria gonorrhoeae < 1%
  • Neisseria meningitidis < 1%

Особенности клинического течения бактериальных кератитов, вызванных наиболее распространенными бактериями

Pseudomonas spp.

Кератит, вызванный сингегнойной палочкой. Источник: webeye.ophth.uiowa.edu Кератит, вызванный сингегнойной палочкой. Источник: webeye.ophth.uiowa.edu Инфекция часто ассоциирована с ношением контактных линз, откуда микроб проникает в ткани через поврежденный эпителий и строму. Кератиты, вызванные Pseudomonas spp. характеризуются быстрым развитием воспаления и значительным увеличением площади поражения за небольшое время (за сутки может увеличиваться вдвое), желто-зеленым отделяемым, гипопионом, выраженной инъекцией перикорнеальных сосудов. Воспаление может перейти на склеру, что вызывает некротизирующий склерит в течение 2-5 дней, что в свою очередь приводит к перфорации. Синегнойная палочка обладает способностью проникать через неповрежденный эпителий, поэтому для начала кератита не требуется наличие травмы или эрозии .

Streptococcus spp.

Стрептококковый кератит. Источник: http://old.www.oculist.net/ Стрептококковый кератит. Источник: http://old.www.oculist.net/

Стрептококки вызывают гемолиз эритроцитов, а сама инфекция часто начинается после травмы либо же ассоциирована с дакриоциститом. Для стрептококковых кератитов типично образование гипопиона, выраженная инъекция перикорнеальных сосудов, образование бляшек, синехий, а также, как осложнение, перфорации роговицы.

Bacillus spp.

Кольцевидный абсцесс. Источник: http://old.www.oculist.net/ Кольцевидный абсцесс. Источник: http://old.www.oculist.net/ Bacillus cereus является Грам(+) палочкой, обитающей в почве, воде и растениях. Инфекция, как правило, развивается в пределах 24 часов после проникающего ранения роговицы. Характеризуется развитием хемоза, проптоза, периферического микрокистозного отека, специфического роговичного абсцесса, имеющего форму кольца.

Staphylococcus spp.

Стафилококковый кератит, вызванный синегнойной палочкой. Стафилококковый кератит. Источник: http://old.www.oculist.net/ Золотистый стафилококк выделяет фермент коагулазу и маннитол и инфекция носит боле агрессивный характер, нежели вызванная S.epidermidis, который не выделяет коагулазу. Стафилококковой инфекции часто предшествует буллезная кератопатия, герпетическая эпителиопатия, диабетическая эпителиопатия, а также перисистирующие дефекты на поверхности роговицы.  S. aureus образует овальной формы дефект с четко выраженными границами, внутри которого виден кремового цвета инфильтрат. . В клинической практике очень важно знать, что существует метициллин-устойчивый S. epidermidis (MRSE), метициллин-устойчивый S. aureus (MRSA) и метициллин-чувствительный S. aureus (MSSA).

Принципы диагностики и лечения

image4

Диагностика

Симптомы

jceh_28_89_03_f04

  • Покраснение глаза
  • Боль
  • Размытое зрение
  • Фотофобия
  • Слезотечение, либо появление отделяемого

Анамнез

Сбор анамнеза является важной частью правильной диагностики бактериального кератита. Необходимо выяснить, были ли какие-либо травмы глаза, если травма была, то какой ее характер. Были ли в анамнезе какие-либо воспалительные заболевания органа зрения до этого, если да, то какое проводилось лечение.  

Острота зрения

  Необходимо проверять остроту зрения на обоих глазах у всех пациентов с кератитами. Причем как с коррекцией, так и без коррекции.  

Осмотр роговицы

jceh_28_89_03_f06 Проводят с помощью офтальмоскопии и биомикроофтальмоскопии. Рекомендуется нанести флюоресцеин-содержащий краситель для того, чтобы можно было объективно оценить характер поражения.

Клинические признаки

  • Воспаление конъюнктивы
  • Наличие отделяемого
  • Дефекты эпителия роговицы
  • Воспалительные инфильтраты в роговице
  • Истончение роговицы или ее перфорация
  • Гипопион

Микробиологическая диагностика

Увы, но одного внешнего осмотра часто бывает недостаточно для того, чтобы определить возбудителя. С целью более точной диагностики и последующего этиотропного лечения, рекомендуется провести микробиологическую диагностику  образцов с поверхности язвы, а также соскоба из ее дна и краев.

Дифференциальная диагностика

Субтотальный грибоквый кератит Субтотальный грибоквый кератит Дифференциальную диагностику проводят с вирусными кератитами, в том числе и вызванными Herpes simplex, акантамебными, и грибковыми кератитами, а также кератитами, вызванными атипичными микобактериями.

Лечение

Антибиотикотерапия

Антибиотикотерапию нужно назначать эмпирически до результатов микробиологической диагностики из-за того, что бактериальный кератит может приводить к тяжелым осложнениям, таким как перфорация роговицы или образование рубца.

Эмпирическое лечение

Цефуроксим + гентамицин или какой-либо фтрохинолон

Аминогликозиды

Тобрамицин и гентамицин

Широкий спектр. Эффективны против MSSA, MRSA. Не эффективны против стрептококков. С бета-лактамами работают синергично.

Амикацин

Обладает крайне широким спектром действия. Эффективны против MRSA, MRSE, обычных микобактерий (Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortium), Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus, Enterobacteriaceae. Не эффективны против стрептококков. К сожалению, встречаются штаммы синегнойной палочки, устойчивые к данному препарату.

Бета-Лактамы

Эффективны против MSSA, стрептококков, грамотрицательных бацилл. Не эффективны против MRSA.

Цефазолин

Хорошая активность против некоторых кишечных граотрицательных микробов и стрептококков. Не эффективны против MRSA, MRSE, P. aeruginosa, S. marcescens.

Цефуроксим

Обычно обладает хорошей эффективностью. против грамотрицательных бацилл, за исключением P.aeuruginosa. Хорошая активной против метициллинчувствительного стафилококка и стрептококков. Не эффективны против MRSA.

Цефтазидим

Эффективен против грамотрицательных бацилл, в том числе Pseudomonas aeuruginosa и S. marcescens. Не эффективен против MRSA и MRSE.

Фторхинолоны (ципрофлоксацин, гатифлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, офлоксацин)

Широкий спектр действия. Эффективны против большинства роговичных патогенов, включая MRSA и Pseudomonas aeruginosa. Не эффективны против Mycobacteriums abscessus, Mycobacterium chelonae. Гатифлоксацин эффективен против грамположительных изолятов. Левофлоксацин обладает высокой эффективностью против стафилококков и стрептококков.

Ванкомицин

Эффективен против грамположительных бактерий, в том числе MRSA и стрептококков.

Симптоматическое лечение

  • Мидриатики (например 1% атропин) для предотвращения развития синехий, а также снижения боли из-за спазма цилиарной мышцы.
  • Обезболивающие препараты перорально
  • Кортикостероиды (Опасно! Применять с большой осторожностью, так как могут существенно усугубить протекание заболевания!)

Автор: Сергей Ткачев

Особая благодарность Александру Панчину за предоставленный список литературы, Артуру Израилову за консультацию по микробиологии и редакции текста, а также Борису Ли за то, что помог в 5 утра перевести пару фрагментов текста.

 Источники:

  1. Dong Q, Brulc JM, Iovieno A, Bates B, Garoutte A, Miller D, Revanna KV, Gao X, Antonopoulos DA, Slepak VZ et al: Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative ophthalmology & visual science 2011, 52(8):5408-5413.
  2. Bonini S, Micera A, Iovieno A, Lambiase A, Bonini S: Expression of Toll-like receptors in healthy and allergic conjunctiva. Ophthalmology 2005, 112(9):1528; discussion 1548-1529.
  3. Buffie CG, Pamer EG.. Microbiota-mediated colonization resistance against intestinal pathogens. Nat Rev Immunol 13: 790-801
  4. Zaidi T, Zaidi T, Cywes-Bentley C, Lu R, Priebe GP, Pier GB: Microbiota-driven immune cellular maturation is essential for antibody-mediated adaptive immunity to Staphylococcus aureus infection in the eye. Infection and immunity 2014, 82(8):3483-3491.
  5. http://old.emedicine.medscape.com/article/1194028-treatment
  6. http://old.eyewiki.aao.org/Interstitial_Keratitis
  7.  Tan CSKrishnan PUFoo FYPan JCVoon LW. Neisseria meningitidis keratitis in adults: a case series. Ann Acad Med Singapore. 2006 Nov;35(11):837-9.
  8. J S Lee, H Y Choi, J E Lee, S H Lee and B S S Oum Gonococcal keratoconjunctivitis in adults Eye (2002) 16, 646–649. doi: 10.1038/sj.eye.6700112
  9. Bacterial Keratitis Infection: A Battle Between Virulence Factors and the Immune Response
  10. http://old.www.oraclinical.com/articles/biomes-biofilm-and-ocular-surface
  11. Upadhyay MP, Srinivasan M, Whitcher JP. Diagnosing and managing microbial keratitis.Community Eye Health. 2015;28(89):3-6.
  12. Stapleton F, Carnt N: Contact lens-related microbial keratitis: how have epidemiology and genetics helped us with pathogenesis and prophylaxis. Eye 2012, 26(2):185-193.
  13. Clinical Ophthalmology,6th edition / JackJ. Kanski. — ISBN 9785986570228
  14. S M Fleiszig, T S Zaidi, E L Fletcher, M J Preston and G B Pier Pseudomonas aeruginosa invades corneal epithelial cells during experimental infection.
  15. Miller D: Pharmacological treatment for infectious corneal ulcers. Expert opinion on pharmacotherapy 2013, 14(5):543-560.