Jason M. Norman, Scott A. Handley, Miles Parkes, Herbert W. Virgin и другие

Резюме

Снижение разнообразия популяций кишечных бактерий наблюдается у пациентов с болезнью Крона (БК) и неспецифическим язвенным колитом (НЯК). Гораздо меньше известно о изменениях вирома при этих заболеваниях. Мы покажем, что кишечный виром ненормален у пациентов, имеющих БК и НЯК. Углубленный анализ препаратов вскрытого кишечника, обогащенных для облегчения независимого существования вирионов, показал, что БК и НЯК были связаны со значительным ростом количества бактериофагов Caudovirales. Виромы от БК и НЯК пациентов были специфичны по заболеванию и когорте. Важно отметить, что расширение и разнообразие кишечного вирома не является вторичным, по отношению к изменениям в популяциях бактерий. Эти данные подтверждают модель, в которой изменения вирома могут способствовать воспалительным изменениям кишечника и бактериальному дисбиозу. Мы пришли к выводу, что виром является кандидатом содействующим (или биомаркером) воспалительным заболеваниям кишечника человека и, предположительно, играть роль в развитии других заболеваний.

Введение

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) являются комплексными заболеваниями со сменяющимися стадиями ремиссии и рецидива и зависящими от различных генетических особенностей и факторов внешней среды. Одним из таких факторов предположительно могут являться микроорганизмы, обитающие в кишечнике (Gevers et al., 2014; Kostic et al., 2014; Minot et al., 2011; Norman et al., 2014; Virgin, 2014). Из всех микроорганизмов на сегодняшний день именно бактерии привлекают больше всего внимания, поскольку они связаны с формированием кишечного иммунитета и минимизацией возможности возникновения воспалительных процессов в кишечнике (данная тема рассмотрена, например, в работе Belkaid and Hand ). Отклонения, в каком либо из данных иммунных процессов могут приводить, к различного рода негативным факторам при развитии ВЗК заболеваний. Например, снижение числа бактерий типа Bacteroidetes и Firmicutes и развитие менее распространенных в норме бактериальных таксонов, также как и изменение в функциях бактериального микробиома, в недавних работах были связаны с болезнью Крона (БК) или язвенным колитом (НЯК) (Kostic et al., 2014; Stappenbeck et al., 2011). Рассматривая влияния бактериального микробиома, на течение кишечных болезней стоит отметить, что контакты внутри семьи между больным и человеком, не страдающим заболеваниями кишечника, могут также приводить к проявлениям бактериального дисбиоза (Joossens et al., 2011). Имеющие контакт, обладают повышенной кишечной проницаемостью (Hollander et al., 1986), и это, позволяет предположить наличие сильной зависимости между бактериальным микробиомом в человеке и окружающей средой, формируемой в доме. Проведенные исследования подтверждают, что среда в доме является определяющим фактором для бактериального микробиома любого индивида, и что между членами семьи возможен обмен бактериями (Lax et al.,2014). Несмотря на то, что данный вопрос на сегодняшний день не изучен подробно, и исходя из представленных результатов, можно предположить, что изучение бактериального микробиома и кишечного вирома при воспалительных заболеваниях кишечника может быть оптимизировано, если исследовать контрольные группы, формируемые в рамках семьи (домочадцев), а не из произвольных здоровых людей. С другой стороны, получаемые данные говорят о том, что вирусная составляющая микробиома, называемая виромом, также может сильно влиять на физиологию своего хозяина (Handley et al., 2012; Norman et al., 2014; Virgin, 2014). Недавние достижения в технологии секвенирования привели к обнаружению сильного разнообразия кишечного вирома человека, состоящего из бактериофагов, а также вирусов эукариот (Breitbart et al., 2003; Finkbeiner et al., 2008; Minot et al., 2011, 2012, 2013; Reyes et al., 2010). Совместно с этим важно отметить, что вирусы эукариот могут изменять течение воспалительных болезней, влияя на генетические маркеры риска ВЗК, что подтверждается работами, основанным на изучении мышей с мутацией в генах Il-10 or Atg16l1 (Basic et al., 2014; Cadwell et al., 2010; Irving and Gibson, 2008; Sun et al.,2011). Бактериофаги также могут играть непосредственную роль в физиологии кишечника или изменении бактериального микробиома через взаимоотношение «хищник-жертва» между фагами и бактериями (Barr et al., 2013; Duerkop et al., 2012; Reyes et al., 2013; Willner et al., 2009, 2012). Виром, основную часть которого составляют бактериофаги, содержит наиболее разнообразные генетические элементы на Земле, определение которых еще только началось (Virgin, 2014). При отсутствии заболевания, популяция бактериофагов в кишечнике существенно отличается от человека к человеку и является лишь временно стабильной (Minot et al., 2013; Reyes et al., 2010), что затрудняет исследования влияния изменения вирома на процессы в организме. Бактериофаги в кишечнике здорового человека в основном представлены фагом Caudovirales, содержащим двухцепочечную ДНК или Microviridae, содеращим одноцепочечную ДНК (Minot et al., 2011, 2013; Minot et al., 2011; Reyes et al., 2010; Waller et al., 2014), которые латентно заражают бактерию-хозяина при отсутствии лизиса бактерии. Однако, внешние стимулы окружающей среды, такие как наличие оксида азота или прием антибиотиков вызывают изменение в функционировании бактериофагов, что в свою очередь выражается в переходе к активному лизису бактерий и заражению соседних клеток (Lindsay et al., 1998; Maiques et al., 2006; Zhang et al., 2000; Zhang and LeJeune, 2008). Этот процесс также приводит к выделению большого количества данных вирусов в объем кишечника, что позволяет выявить их при соответствующем анализе. Это позволило провести ряд исследований, на основе заключений которых было предположено, что изменение в разнообразии бактериофагов происходит при болезни Крона (Lepage et al., 2008; Pe´ rez-Brocal et al., 2013; Wagner et al.,2013). Однако в данных исследованиях детально не определялся кишечный виром и не производился учет факторов внутри семьи, которые, как говорилось выше, могут влиять на микробиом. В данной работе, мы сравнили виром кишечника обычного человека и человека с ВЗК исследуя, методом метогеномного секвенирования ДНК, препараты вирусо-подобных частиц (VLP) из образцов кала, полученных от пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом и контрольных групп. В ходе исследования, мы сопоставили два экологических показателя – общее количество (количество таксонов на один исследуемый образец) и разнообразие. Разнообразие, как параметр, определяется общим количеством и сравнительным количеством (или по-другому равномерностью) представленных в образце таксонов; изменение в разнообразии могут возникать как следствие изменения или общего количества или равномерности. Сравнение результатов детального анализа вирионов в VLP препаратах, а также секвенирования 16S рибосомальной РНК, полученных в ходе проведения продольного исследования группы пациентов и контрольных групп, представленных домочадцами пациентов (далее – семейными контрольными группами) показало снижение общего количества и разнообразия бактерий совместно с резким увеличением количества бактериофагов, связанных с ВЗК. Полученные данные согласуются для двух независимых групп пациентов, имеющих различную географическую принадлежность. Таксономическая структура кишечного вирома и бактериального микробиома при заболеваниях БК и НЯК, различается для контрольных групп с различной географической принадлежностью, что проявляется в наличии специфичных вирусов и бактерий. Все вместе, это подкрепляет модель, которая предполагает, что вызванное ВЗК увеличение общего количества бактериофагов связано не только с увеличением их количества в клетках-хозяевах. Были отмечены и положительные и отрицательные корреляции между специфичными вирусными и бактериальными таксонами. Представленные данные в первый раз демонстрируют, что уникальные изменения бактериофагальной части кишечного вирома происходят при наличии болезни Крона или язвенном колите, что увеличивает вероятность влияния данных изменений на патогенез заболевания, вследствие изменения взаимоотношения между бактериофагами и бактериями-хозяевами. Полученные результаты предоставляют возможность, говорить о необходимости диагностики кишечного вирома при наличии ВЗК, и о возможности формирования нового терапевтического подхода к лечению ВЗК на основе внешнего управления кишечным виромом. А также подчеркивает необходимость более полного понимания взаимодействия между вирусами и бактериями в рамках микробиома при рассмотрении других заболеваний, при которых отмечается изменение бактериального микробиома (Duerkop and Hooper, 2013; Norman et al., 2014; Virgin, 2014).

Результаты

Изменения вирома наблюдались в нескольких когортах

Для того, чтобы изначально определить кишечный виром, соответствующий ВЗК, было выполнено метагеномное секвенирование подготовленных образцов кала трех независимых когорт, состоящих из семейных контрольных групп с наличием или отсутствием ВЗК, используя платформу Roche 454 (Таблицы S1 и S2местоположение контрольных групп – Кембридж, Великобритания; Чикаго, США; Лос-Анжелес, США). В среднем, авторы получили 32,591±27,531 последовательностей (значение±стандартное отклонение), которые были 282±47 нуклеотидов в длину, из 72 образцов кала (Таблица S3, 12 семейных контрольных групп, 18 пациентов с болезнью Крона и 42 пациента с язвенным колитом). Последовательности были обработаны и определена таксономия образца. Большая часть полученных последовательностей принадлежала человеку или бактериям (таблицаS3). Также было обнаружено, что бактериофаги Caudovirales и Microviridae являются наиболее распространенными отрядами во всех когортах (Рис.1А), что соответствует опубликованным результатам ранее проведенных исследований (Minot et al., 2011; Reyes et al., 2010). Все другие вирусы были представлены в малых количествах и формировали менее 5% от всех вирусных последовательностей. Сравнительный анализ численности последовательностей, проведенный для всех трех когорт, показал наличие отрицательной корреляции между популяциями Caudovirales и Microviridae (Рис. 1, B). Данная отрицательная корреляция была также продемонстрирована, когда семейные контрольные группы, пациенты с болезнью Крона, а также пациенты с язвенным колитом анализировались по отдельности (полученные данные не представлены в работе). Сравнивая семейные контрольные группы с пациентами, болеющими ВЗК в рамках когорты, расположенной в Великобритании, авторы делают вывод, что данная непропорциональность в количестве различных бактериофагов связана с наличием ВЗК (Рис.1, С). В корне различные количества Caudovirales и Microviridae были также отмечены у пациентов из Лос-Анжелеса. Такая сильная корреляция между заболеванием и изменением последовательностей, представленных в кишечном вироме, в некотором роде удивительна, учитывая разнообразие в географическом расположении и параметрах окружающей среды, присущих разным когортам.

: Norman et al., Disease-Specific Alterations in the Enteric Virome in Inflammatory Bowel Disease, Cell (2015), http://old.dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.01.002

Norman et al., Disease-Specific Alterations in the Enteric Virome in Inflammatory Bowel Disease, Cell (2015),

(А) Относительная распространенность последовательностей, относящихся к отдельному таксону вирусов. (B) Корреляционная зависимость между распространенностью бактериофагов Caudovirales и Microviridae для всех образцов. Величина линейной регрессии наблюдается на ±95% доверительном интервале и коэффициент корреляции Спирмена. (С) Относительное распространение фагов Microviridae и Caudovirales в образцах семейных контрольных групп, пациентов с болезнью Крона и язвенном колитом (верхняя часть изображения); Пациентов с болезнью Крона и язвенном колитом в Чикаго и Лос-Анжелесе (нижняя часть изображения). Статистическая значимость определена с использованием U-критерия Манна — Уитни.

Углубленный анализ свободных вирионов в энтеральном вироме при ВЗК

Проведенные первоначальные исследования и их результаты побудили авторов провести детальный анализ вирома путем метагеномного секвенирования вирусо-подобных частиц, полученных из кала пациентов и здоровых людей из 17 семей, в которых имеются люди с ВЗК, в Великобритании (Рис.2, А и таблицы S1 и S2). Вирусо-подобные частицы обогатили свободные вирионы (Reyes et al., 2012; Thurber et al., 2009).Чтобы уточнить взаимосвязь между ВЗК и кишечным виромом и чтобы принять во внимание ранее полученную информацию, что бактериальный микробиом и виром идентичен у всех представителей семьи (домочадцев) (Lax et al., 2014; Reyes et al., 2010), мы сравнили результаты для пациентов с ВЗК и соответствующих семейных контрольных групп (содержащих людей с ВЗК) (Рис. 2, А). Проведение данного анализа крайне важно для исследования вирома, учитывая значительное различие в вирусах, представленных в каждом отдельном человеке (Reyes et al., 2010). Все образцы как у пациентов с ВЗК, так и у семейных контрольных групп были взяты в период обострения болезни. В общей сложности, для выделения вирусо-подобных частиц использовался 21 образец от семейной контрольной группы и 52 образца от пациентов с ВЗК (24 в острый период и 28 в латентный период; 36 с язвенным колитом и 16 с болезнью Крона). Для подтверждения получаемых данных исследование также проводилось в двух дополнительных когортах в Чикаго и Бостоне, которые также содержали больных ВЗК и здоровых людей (более полно рассмотрено далее; таблицы S1 и S2) При исследовании когорты в Великобритании было получено 1,111,569±493,164 двухцепочечных последовательностей на образец с средним качеством секвенирования 36,5±3,7 (Таблица S4). Дополнительная обработка результатов с учетом качества привела к сокращению в среднем на 2% всех последовательностей до значения 1,094,360±503,337 с средним снижением длины последовательности с 250 до 241,7±3,7 пар и при среднем увеличении качества до 1,0±0,03. В данном случае отсутствовала статистически значимая разница в количестве последовательностей общем случае или с учетом контроля качества секвенирования между образцами контрольной группы и пациентов имеющих ВЗК (рисунок S1A). Последовательности были кластеризованы по условию 95% идентичности, с целью удалить все одинаковые последовательности и сформировать массив уникальных последовательностей, с которыми возможна работа в дальнейшем. В результате кластеризации произошло уменьшение общего количества последовательностей на 89% до значения 112,192±71,820 уникальных последовательностей на образец. Интересно, что несмотря на отсутствие значительной разницы между общим набором полученных последовательностей, было отмечено наличие значительно большего количества уникальных последовательностей в образцах, полученных от пациентов с болезнью Крона по сравнению с образцами от контрольных групп или пациентов с язвенным колитом (рисунок S1A).

Norman et al., Disease-Specific Alterations in the Enteric Virome in Inflammatory Bowel Disease, Cell (2015),

(А) Образцы кала в когорте из Британии были собраны у пациентов с ВЗК и их домочадцев без данных заболеваний на момент начала проявления симптомов (отмечены красным) и когда симптомы прошли. Длительность проявления симптомов ВЗК отмечены красным овалом. Образцы обозначены в соответствии ID семьи и номером образца (B) Образцы пациентов с язвенным колитом из Чикаго были собраны в период ремиссии и повторно во время усугубления симптомов.

Увеличение таксономического разнообразия Caudovirales, ассоциированное с ВЗК

Полученные последовательности были сравнены с базой данных по вирусным белкам. Нам удалось определить принадлежность к вирусным таксонам 17,022±15,725 последовательностей (15%) (рисунок S1A), большая часть принадлежала к бактериофагам отряда Caudovirales и Microviridae (рисунок S1B). Последовательности также принадлежали к большему количеству менее распространенных вирусов, включая бактериофаги, обитающих в бактериях, обычно обнаруживаемых в образцах кала человека, а также обычные вирусы эукариот (Рис S1B). Анализ образцов также показал низкий уровень загрязнения последовательностями, связанными с клетками человека (0%-4%). Возможное загрязнение бактериальными последовательностями может быть связано с наличием в их структуре генома бактериофагов, фиксирование которого приводило к выделению всей последовательности, которая принадлежала бактерии. Мы сопоставили полученные из образцов когорты исследуемых в Британии последовательности с геномом вируса Assphage и как результат отметили его наличие в 71% образцов (Dutilh et al., 2014) (Таблица S4). Процент последовательностей, относящихся к данному вирусу, крайне сильно различался и составлял от 1% до 89% от общего количества последовательностей в образцах при отсутствии связи данных значений с параметрами болезни или влияния лекарств, что не позволяет сделать объективных выводов относительно его присутствия и связи с болезнями. Интересно, что мы обнаружили рост общего количества бактериофагов, в особенности, относящихся к отряду Caudovirales в образцах больных с ВЗК. (Рис. 3,А. и 3, B). По словам авторов, данное различие вряд ли может быть связано с неравномерным количеством образцов или уникальными последовательностями в контрольных группах и группах больных, поскольку частота получения новых таксонов бактериофагов значительно опережает появление новых таксонов в образцах контрольной группы (Рис.3,B). С другой стороны отмечается отсутствие роста общего количества или разнообразия для бактериофагов отряда Microviridae(Рис S2A), что говорит о развитии бактериофагов в рамках определенного таксона и что методики, используемые авторами, сами по себе не приводят к систематическому увеличению общего количества бактериофагов в образцах больных с ВЗК по сравнению с образцами контрольной группы. Ряд образцов больных с ВЗК содержал значительно меньшее количество фагов отряда Microviridae по сравнению с образцами контрольной группы, что дополнительно подтверждает значительное различие в виромах на двух различных стадиях болезни (Рис. S2A) Таксономическое распределение полученных контигов с длиной более чем 1,000 нуклеотидов также говорит о том, что фаги отряда Caudovirales присутствуют в большем количестве в образцах пациентов с ВЗК (Рис. 3,С). Эти данные говорят о том, что образцы вирусо-подобных частиц содержат в себе частичные или полные геномы вирусов и что подавляющее большинство определенных геномов принадлежат именно к Caudovirales бактериофагам. Суммируя все сказанное, последовательности и полученные контиги, присущие фагам отряда Caudovirales, в значительной степени по разному распространены в образцах, относящихся к больным БК и НЯК и семейным контрольным группам и как следствие могут совершенно по разному влиять на микробиом и проявление имунной реакции.

Norman et al., Disease-Specific Alterations in the Enteric Virome in Inflammatory Bowel Disease, Cell (2015),

(А) Графическое сопоставления последовательностей, характерных для представителей таксона Caudovirales, и последовательностей в образцах, полученных авторами в когорте из Британии. (B) Общее количество представителей отряда Caudovirales, определенное на основе наличия индивидуальных последовательностей. (C) Общее количество представителей отряда Caudovirales, определенное с использованием поиска соответствия контигов. (D) Диаграмма Венна для таксона Caudovirales в семейных контрольных группах, пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом. N определяет количество образцов в каждой из групп. (E) и (F) Относительное распространение для 35 наиболее распространенных представителей таксона Caudovirales в когорте из Великобритании.

Специфические для ВЗК изменения в кишечном вироме

Кроме разницы в общем количестве бактериофагов между пациентами с ВЗК и семейными контрольными группами, авторами также было обнаружено существенное различие в количестве и видах таксонов бактериофагов между образцами больных болезнью Крона и язвенным колитом(Рис. 3 D). Значительное количество таксонов обнаружено во всех образцах; однако, каждой болезни соответствует свой определенный набор бактериофагов. Данные различия в таксонах фагов Caudovirales может являться результатом множества различных факторов, включая состояние здоровья или параметры заболевания, семейные особенности, активность протекания болезни, возраст, пол и/или прием определенных лекарств. Мы решили применить мультивариантный анализ определения численности фагов отряда Caudovirales с использованием MaAsLin (Мультивариантные ассоциации с линейным моделированием) сравнивая последовательности образцов больных ВЗК и их семейных контрольных групп (Morgan et al., 2012).В рамках данного метода определено 35 различных фагов Caudovirales, которые связаны с различными семейными группами (общее количество соответствий – 43) (Таблицы S5 и S6). Такая взаимосвязь также была отмечена при построении относительной численности фагов Caudovirales, которое демонстрирует ее сохранение в рамках одной семейной группы (Рис. 3,E). Полученные данные соответствуют ранее полученным результатам (Reyes et al., 2010). Пять видов Caudovirales, определенные методикой MaAsLin в значительной степени связаны именно с наличием болезней, включая наличие последовательностей, которые могут принадлежать к бактериофагам Lactococcus, Lactobacillus,Clostridium, Enterococcus, и Streptococcus (Таблица S6). Совместно с ростом общего количества бактериофагов Caudovirales в образцах, соответствующих болезни Крона, также наблюдается и рост разнообразия представленных бактериофагов (Рис S2B). Подобные особенности не были обнаружены в образцах, соответствующих язвенному колиту, что говорит о наличии различий в кишечном вироме при болезни Крона или язвенном колите.

Обратная зависимость между ВЗК-ассоциированными изменениями в вироме и бактериальном микробиоме

В качестве следующего шага мы решили проверить, является ли увеличение количества бактериофагов, наблюдаемое при болезни Крона или язвенном колите связанным с параллельным изменением в популяции бактерий. Для того, чтобы ответить на этот вопрос, мы выполнили секвенирование гена 16S рибосомальной РНК (Таблицы S1 и S2). Как результат, мы в среднем получили 64,107 ± 38,570 последовательностей, которые после кластеризации элементов с 97% идентичностью дали 56,096 ± 32,774 таксономических единиц (operational taxonomic units (OTUs)) на образец (Таблица S7). Как и ожидалось, для болезни Крона и язвенного колита имелось характерное значительное снижение в разнообразии и общем количестве бактерий по сравнению с образцами контрольной группы. (Рис.4,А и 4,B). Однако, также было обнаружена значительная схожесть в бактериальном микробиоме в рамках членов семьи человека с ВЗК определенную перестановками мультивариантного анализа расхождения взвешенных UniFrac интервалов (Рис 4B и 4C; ADONIS p = 0.001, 999 permutations). (McArdle and Anderson, 2001). Что также интересно, у пациентов, образцы которых изучались в течение продолжительного времени, бактериальное разнообразие не восстанавливалось даже в латентные периоды как болезни Крона, так и при язвенном колите (Рис. 4, B и 4, С). Также как и в случае бактериофагов, изменение в разнообразии бактерий также может являться следствием множества различных факторов. Авторами также был применен мультивариантный анализ с использованием методики MaAsLin (Morgan et al., 2012). В результате данного анализа авторы идентифицировали 18 различных бактериальных таксонов, которые соответствовали наличию болезни или активности ее протекания (Таблицы S5 и S8).Основная масса важных таксономических единиц была представлена бактериями типа Bacteriodetes и Firmicutes, включая также значительное количество различных представителей семейства бактерий Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Bacteriodaceae, и Prevotellaceae. Следовательно, как и ожидалось, в исследуемой когорте было обнаружено изменение в представленных таксонах бактерий, связанное с заболеваниями. Однако важно отметить и следующий факт – эти изменения также наблюдаются и для домочадцев больного, что подтверждает ранее опубликованные исследования, говорящие о связи между биомом больных ВЗК и контактирующих с ними людей (Joossens et al., 2011). Важно отметить, что снижение разнообразия бактерий обратно связано с увеличением количества бактериофагов Caudovirales у больных ВЗК. Сравнивая параметры колоний бактерий и бактериофагов Caudovirales в образцах семейных контрольных групп, больных БК и НЯК, можно отметить различие между результатами для различных стадий болезни (Рис. 5,A). В когорте исследуемых из Великобритании, позитивная корреляция наблюдается для 5 из 6 возможных соответствий между количеством бактерий и их разнообразием и количеством бактериофагов и их разнообразием. С другой стороны, имеется отрицательная корреляция в образцах для болезни Крона между разнообразием фагов Caudovirales и общего количества и разнообразия бактерий, говоря о том, что увеличение количества фагов является не просто результатом увеличения количества бактерий-хозяев. (Рис 5А) Для того, чтобы лучше охарактеризовать связь между фагом Caudovirales и таксонами бактерий, мы рассчитали корреляционный коэффициент Спирмена относительно таксонов Caudovirales и семействами бактерий значительно измененными в процессе болезни, что было установлено с помощью анализа MaAsLin. Подобное целое разнообразие и богатство корреляций, обратные корреляции между Caudovirales и значительно модифицированными бактериальными таксонами распространено в Великобритании у пациентов имеющих БК(Рис 5B). В результате было отмечено, что в частности семейство бактерий Bacteroidaceae имеет обратную корреляцию по отношению к таксонам фагов Caudovirales в случае болезни Крона. Это соответствует уменьшению относительного количества данного таксона бактерий у пациентов с болезнью Крона в сравнении их родственниками из контрольной группы. С другой стороны, фаги Caudovirales связаны позитивной корреляцией с семействами бактерий Enterobacteriaceae и Pasteurellaceae в случае болезни Крона. При этом в случае семейств Enterobacteriaceae и Pasteurellaceae отсутствовали значительные изменения в их количестве, что позволяет утверждать отсутствие связи данной корреляции с ошибочностью подсчета количества последовательностей фагов Caudovirales в результате учета генома фагов, внедренного в последовательности бактерий. Несколько дополнительных положительных и отрицательных корреляций были также обнаружены у пациентов с язвенным колитом, кроме значительного распространение бактериофагов Caudovirales и снижения бактериального разнообразия у данных пациентов (Рис. 3, б и 4,а), позволяя говорить о наличии специфичных особенностей кишечного вирома и бактериального микробиома у пациентов с язвенным колитом по сравнению с болезнью Крона.

Norman et al., Disease-Specific Alterations in the Enteric Virome in Inflammatory Bowel Disease, Cell (2015),

(A) Альфа-разнообразие и общее количество бактерий, полученные на основе анализа последовательностей 16S рибосомальной РНА в образцах контрольной группы, пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом. (B и C) Величина альфа-разнообразия, нормализованного к разнообразию в контрольных группах (верхняя часть) и относительной распространенности бактерий (нижняя часть) для пациентов с болезнью Крона (B) и язвенным колитом (C). Зелеными числами обозначены контрольные группы; фиолетовыми – пациенты с болезнью Крона; красными – с язвенным колитом.

Norman et al., Disease-Specific Alterations in the Enteric Virome in Inflammatory Bowel Disease, Cell (2015),

(А) Графическое представление коэффициента корреляции Спирмена для величины общего количества фагов Caudovirales, Индекс Шеннона, альфа разнообразие бактерий и общее количество бактерий, полученные в контрольной группы из Великобритании, пациентов с язвенным колитом и болезнью Крона. Статистическая значимость была определена для всех парных сравнений; представлены значения, для которых p<0,05. Позитивные значения, представленные синими кружками, отражают позитивные корреляции и негативные значения, представленные красными кружками, отражают отрицательные корреляции. Форма и величина кружка отражают величину корреляции, более темный окрас соответствует большей степени корреляции по сравнению со светлыми окрасом. (B) Значение коэффициента Спирмена относительной распространенности для 50 наиболее распространенных таксонов Caudovirales и семейств бактерий, связанных с болезнью. В верхней части представлены данные для контрольных групп, в средней части изображения представлены результаты для болезни Крона и в нижней – для язвенного колита. Серым отмечены значения для таксонов, которые не были отмечены в контрольной когорте. Статистическая значимость была определена для всех парных сопоставлений; отображены только корреляции с p<0.05

Независимые ВЗК когорты для валидации изменений в вироме

Нами принималось во внимание, что полученные результаты при исследовании больных ВЗК в Великобритании могут быть связаны также или с географическими особенностями или оказаться в целом не воспроизводимыми. Для проверки полученных результатов аналогичное исследование было проведено с привлечением двух дополнительных когорт пациентов с БК и НЯК заболеваниями (Рис 2 и таблицы S1 и S2). В данных случаях отсутствовала контрольная группа, представленная домочадцами пациентов, и как результат сравнение проводилось с результатами контрольной группы, представленной здоровыми людьми, не связанными с пациентами. Первая когорта была представлена жителями Чикаго и состояла из 23 здоровых людей и 25 пациентов с ВЗК (18 с язвенным колитом и 7 с болезнью Крона) (Рис 1).. Для пяти из пациентов с ВЗК удалось получить образцы, как в латентный период, так и в период острого течения болезни (Рис 2B). Кроме того, для двух пациентов с язвенным колитом в качестве контрольной группы взяты их родственники. Вторая когорта была сформирована из жителей Бостона и состояла из 10 здоровых людей и 25 пациентов с ВЗК (11 с язвенным колитом и 14 с болезнью Крона).

Зависимость между увеличением Caudovirales и ВЗК внутри когорты

Как и ожидалось, у пациентов с язвенным колитом и болезнью Крона в рамках представленных когорт наблюдалось снижение общего количества бактерий и их разнообразия по сравнению с образцами контрольной группы как для когорты из Чикаго, так и из Бостона (Рис. 6,А – 6,С). Анализ с использованием методики MaAsLin показывает наличие связи между бактериальными таксонами и ВЗК в обеих когортах, однако, при этом, меньшее количество бактериальных таксонов можно было связать с ВЗК, в сравнении с результатами исследований, в рамках когорты из Великобритании, в которой в качестве контрольной группы выступали домочадцы пациентов (Таблицы S5 и S8). Также как и в случае когорты из Великобритании (рис 3), было обнаружено значительное увеличение количества бактериофагов отряда Caudovirales у пациентов с ВЗК для обеих когорт из США (Рис.7). Однако, общее количество и разнообразие бактериофагов в образцах двух разных когорт, из Бостона и Чикаго, различалось. В группе из Чикаго, у пациентов с болезнью Крона отмечено увеличение количества фагов Caudovirales по сравнению с контрольной группой (Рис 7A и 7B). Это было очевидно, когда разнообразие было оценено как для индивидуальных последовательностей, так и для Caudovirales контигов. В группе из Бостона увеличение количества фагов Caudovirales отмечено как для болезни Крона, так и для язвенного колита, при этом в случае язвенного колита наблюдалось большое количество контигов по сравнению с болезнью Крона (Рис 7A и 7B). Также был обнаружен уникальный Caudovirales таксон в образцах, соответствующих пациентам с язвенным колитом и болезнью Крона из обеих когорт (Рис.7,с), который ожидалось согласно ранее полученным результатам исследований в Великобритании и высокому межвиромному разнообразию (Reyes et al., 2010). Мультивариантный анализ относительной численности фагов Caudovirales в образцах из Чикаго и Бостона также показал наличие некоторых особенностей, связанных с болезнью (Таблицы S5 и S6). У нас отсутствовала возможность выполнить корреляционный анализ для того, чтобы определить связь между бактериофагами и их влиянием на численность бактерий (как это представлено на Рис.5) вследствие недостаточного количества бактериальных таксонов, связанных параметрами болезни (Таблица S8). Как следствие, в данном случае авторам не удалось определить специфическую связь между бактериофагами и таксонами бактерий в данных когортах. Однако все же полученные результаты позволяют сказать, что наличию таких заболеваний, как болезнь Крона и язвенный колит соответствует увеличение популяции бактериофагов Caudovirales, что подтверждается исследованием трех различных когорт и при условии различных контрольных групп.

Эукариотические вирусы в ВЗК-когортах

Нами также провелось исследование последовательностей вирусов эукариот, полученных при обработке образцов больных ВЗК всех трех когорт (Таблица S4). Преобладающим в образцах с ВЗК по сравнению с контрольными группами оказались последовательности, относящиеся к Анелловирусу. Однако последовательности анелловируса из образцов кала были получены не у всех пациентов, а также отсутствует какая либо их взаимосвязь с течением болезни и приемом лекарств.

Norman et al., Disease-Specific Alterations in the Enteric Virome in Inflammatory Bowel Disease, Cell (2015),

(A и B) Филогенетическое разнообразие (слева) и количество бактерий (справа),определенные на основе секвенирования 16S рибосомальной РНК образцов контрольных групп, больных язвенным колитом и болезнью Крона из (А) Чикаго и (B). Погрешности определены как значение ± стандартное отклонение. Статистическая значимость была определена на основе критерия Краскела-Уоллиса с поправкой Бонферрони при сравнении всех образцов друг с другом. *p > 0.05 and **p > 0.01. (С) Альфа-разнообразие нормализованное относительно общего разнообразия для здоровых людей (верхняя часть изображения) и относительной распространенности семейств бактерий (нижняя часть изображения) для когорт из Бостона и Чикаго. Отображены образцы контрольной группы, больных язвенных колитом и болезнью Крона. Образцы, полученные в ходе лонгитюдного исследования, сгруппированы вместе.

Norman et al., Disease-Specific Alterations in the Enteric Virome in Inflammatory Bowel Disease, Cell (2015),

(А и B) Кривые зависимости общего количества фагов отряда Caudovirales при увеличении количества подвыборок с перестановкой для когорт из Чикаго (верхняя часть) и Бостона (нижняя часть). (A) Количество фагов Caudovirales, определенное на основе индивидуальных последовательностей. (Б) Количество фагов Caudovirales, определенное на основе анализа контигов (С) Диаграмма Венна для таксона Caudovirales в контрольной группе, при язвенном колите и болезни Крона из Чикаго (верхняя часть изображения) и Бостона (нижняя часть изображения). Под N понимается количество образцов в пределах каждой группы.

Обсуждение

В этой статье, мы продемонстрировали, что болезнь-специфические изменения в кишечном вироме происходят при обеих основных формах ВЗК: болезни Крона и неспецифическом язвенном колите. С увеличенной силой, это наблюдалось в когорте больных по сравнению с контрольной группой семьи. Целью было обнаружить болезнь-ассоциированные изменения в метагеноме и объявить их действительными в двух независимых и географически различных когортах, содержащих группы контроля. Основным изменением в вироме, связанным с ВЗК, было значительное расширение таксономического богатства бактериофагов Caudovirales. Важно отметить, что, хотя это изменение наблюдалось и при БК, и при НЯК, вирусы, ответственные за изменения, как оказалось, различаются. Предполагается, что виром специфичен для БК в сравнении с ЯК. Сравнения разных когорт показали, что кишечные виромы были уникальны как между отдельными лицами, так и между когортами, что согласуется с предыдущими докладами о невероятном разнообразии вирома человеческого кишечника (Minot et al., 2011; Reyes et al., 2010). Хотя изменчивость кишечных бактерий и вирусов вне семейной контрольной группы и пациентов с ВЗК, затрудняет возможность заметить определенные отношения между индивидуальными бактериофагами и индивидуальными бактериальными таксонами, увеличение разнообразия бактериофагов, несмотря на снижение бактериального богатства и разнообразия, происходит в соответствии с ВЗК. Наши данные согласуются с сообщениями о том, что большее количество последовательностей бактериофагов Caudovirales обнаруживается в кишечных смывах и биопсии тканей педиатрических больных, в сравнении БК с не воспалительными заболеваниями (Wagner et al., 2013). Перечислено больше вирионов Caudovirales в микроскопии биопсии и смывах больных БК (Lepage et al., 2008). Мы считаем, что наши наблюдения отражают экспансию инфекционных бактериофагов при ВЗК, по двум причинам. Во-первых, мы секвенировали вирусо-подобные частицы, подготовлнные для обогащения вирионов. Во-вторых, экспансия умеренными бактериофагами, интегрированными в бактериальные геномы, могла бы прогнозировать их положительную коррелляцию с бактерией-хозяйкой, но пока мы наблюдаем обратную корреляцию. Тем не менее, наши данные не исключают возможность того, что бактериальные виды, укрывающие определенные профаги также широки. Для анализа этого потребуется полное секвенирование бактериального микробиома и дополнительный анализ бактериальных таксонов с помощью анализа 16S рибосомальной РНК последовательности.

Потенциальная роль бактериофагов при IBD

В кишечнике человека, как и во многих других экосистемах, преобладающими бактериофагами являются: имеющие хвост dsДНК Caudovirales и не имеющие его ssДНК Microviridae. (Breitbart et al., 2003; Reyes et al., 2010). Биология бактериофагов была всесторонне проанализирована (Brussow et al., 2004; Clokie et al., 2011; Fortier and Sekulovic, 2013). Увеличение количества бактериофагов отряда Caudovirales, которое обнаружено авторами, может возникать вследствие воспроизведения фага в бактериях или отражает появление новых вирусов, поступающих из внешней среды, в частности вместе с едой или например при контакте с домочадцами. Подобные изменения могут приводить к серьезным последствиям, для бактериального микробиома. В частности, бактериофаги являются одним из основных параметров, определяющих разнообразие бактерий и их соответствие окружающей экосистеме (Bru¨ ssow et al.,2004). В кишечнике бактериофаги отвечают за горизонтальный перенос генетического материала между бактериями, включая и тех, которые являются патогенными, а также устойчивыми к антибиотикам (Bru¨ ssow et al., 2004; Maiques et al., 2006; Zhang and LeJeune, 2008). Изменения, вызываемые бактериофагами, мутации или влияние иных внешних факторов могут в значительной мере менять устойчивость бактерий. Кроме того, необходимо учитывать возможность протекания процессов лизиса бактерии, что также может приводить к серьезным изменениям в микробиоме (Weitz and Wilhelm, 2012). Как было показано в работе Reyes et al., 2013, кишечный микробиом крайне чувствителен к изменению популяции бактериофагов, что выражается в изменении его бактериального состава. Лизис бактерий также приводит к выделению в среду протеинов, липидов и нуклеиновых кислот, которые выступают в качестве патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMPs) и антигенов, которые запускают провоспалительные каскадные сигналы, повреждение тканей и изменение клеточной проницаемости. Данная тема требует дополнительных исследований, включающих в себя разработку моделей, в которых возможно более полное исследование деталей механизма «хищник-жертва» относительно бактериофагов и бактерий. Другим потенциальным следствием в изменении кишечных бактериофагов может быть возникновение прямого воздействия бактериофагов на организм хозяина. Например, бактериофаги могут перемещаться из желудочно-кишечного тракта в соматические системы животных (Go´ rski et al., 2006) и людей (Parent and Wilson, 1971). Бактериофаги также могут вызывать ответные реакции гуморальной иммунной системы (Uhr et al., 1962). Кроме того, стимуляция макрофагов элементами бактериофагов вызывает MyD88-зависимое формирование проинфламоторных цитокинов. (Eriksson et al., 2009). Хроническое воспаление кишечника является основной частью любой патологии воспалительных заболеваний кишечника, которая приводит к разрушению тканей кишечника и усилению проницаемости эпителиальной ткани. Это приводит к увеличению системного воздействия на поток микробных иммуногенов, возможно, в том числе и бактериофагов, и лизису бактериальных клеток, сохранению и еще более усугублению воспаления. По этим причинам, бактериофаги могут служить антигенами, которые стимулируют иммунитет хозяина и воспаление.

«Темная материя» вирома

Метагеномное секвенирование образцов, обогащенных интактными вирионами, привело к пониманию невероятной насыщенности кишечных вирусов в организме человека. Важно отметить, что методы, которые мы использовали здесь, не предполагали, обнаружение оболочечных вирусов или РНК вирусов, и помогли многое узнать об этих аспектах вирома ВЗК. Предыдущие попытки с использованием данных методов, характеризующих виром, были в состоянии назначить лишь от 60% до 87% последовательностей вирусо-подобных частиц или контигов в пределах последовательностей баз данных (Minot et al., 2011, 2013). Среи наших когорт, мы были в состоянии назначить в среднем только 14% от последовательностей вирусоподобных частиц вирусной базы данных. Кажущееся противоречия, между нашим и предыдущими исследованиями, можно объяснить использованием нами более высокой пропускной способности на основе секвенирования, базы данных последовательностей, или таксономических критериев назначения. Проценты идентичности этих последовательностей вирусоподобных частиц, которые были назначены в данном исследовании, сильно варьировалось в подмножестве последовательностей, которые были проанализированы (от 40% до 100% идентичности, данные не приведены). Это главная проблема для будущих исследований, так как мы оказались в состоянии сообщить только о бактериофагах, которые наиболее тесно связанны с таксонами в базе данных. Вполне вероятно, что дополнительные вирусы присутствуют секвенируемых нами наборах данных, но не обнаруживаются в связи с этим ограничением. Следствием этого является то, что глубина текущих баз не достаточна для того, чтобы быть в состоянии связать конкретные бактериофаги для отдельных бактерий или болезни. Это ограничение будет преодолено только со значительным расширением последовательностей бактериофагов в доступных базах данных. Это не простая задача и она требует глобальных скоординированных усилий, для улучшения вирусных баз; ясно, что с проектом «микрофлора человека» (http://old.www.hmpdacc.org/), улучшилась способность классифицировать и изучить бактерии. С улучшением баз данных, разрешение нашей картины бактериальных ассоциаций микробиом-виром улучшится. Многие из последовательностей, которые мы не назначили, используя нашу карту вирусной базы данных в бактериальных геномах (данные не показаны), осложняют задачу тем, что многие бактериальные последовательности генома содержат профагов, которые не были самостоятельно аннотированны. Обращение к некорректной аннотации интегрированных профагов, как «бактериальных» последовательностей, потребует разработки новых инструментов и значительного улучшения вирусных баз данных, содержащих гораздо большее разнообразие полностью аннотированных полных вирусных геномов.

Значение вирома для патогенеза, терапии и мониторинга заболевания

Основной терапевтической целью в ВЗК является ограничение воспаления и остановка или даже обращение разрушения тканей. Во многих случаях, фармакологическое или биомолекулярное лечение терпми неудачу, и требуется хирургическое лечение в воспаленной/ поврежденной ткани. Таким образом, необходимы новые подходы для оптимизации управления ВЗК. Одним из возможных подходов, является манипулирование кишечными бактериями, через пробиотиков и пребиотиков, которые до сих пор имели ограниченный успех в испытаниях на людях (Butterworth et al., 2008; Naidoo et al., 2011; Shanahan and Quigley, 2014). Фекальные трансплантации от здоровых доноров или с подходом к установлению бактериальных культур, набирают обороты из-за их успеха в лечении повторяющейся клостридиальной тяжелой инфекции (van Nood et al., 2013). Тем не менее, первые попытки лечения бактериального дисбиоза при БК путем фекальной трансплантация не оказались успешными (Angelberger et al., 2013; Kump et al., 2013), возможно из-за нестабильности донорского микробиома у пациентов с воспалительной болезнью кишечника. Это позволяет предположить, что заболевание ассоциировано с таксономическим богатством вирома у реципиента, который может взаимодействовать с донорским микробиомом, ограничивая эффективность пробиотических или фекальных трансплантаций. Определение вирома до и во время применения пробиотика или фекальной трансплантации требовать оценки этой возможности. Следует отметить, что, в моделях на животных, вирусы эукариот изменяли кишечную биологию и воспаление, действуя совместно с бактериями хозяина зависящим от генетики хозяина образом (Basic et al., 2014; Cadwell et al., 2010). Таким образом, вирусы эукариот и бактериофаги могут играть роль в ВЗК посредством взаимодействия с бактериальным микробиомом. Это имеет большое значение, для более полного понимания взаимодействия между бактериями и вирусами и вирусами и хозяином, позволяет разрабатывать и персонализировать эти подходы к управлению ВЗК. Наши данные также показывают, что удельное расширение бактериофагов при БК, связано со снижением бактериального разнообразия. Разработка методов, которые блокируют инфицирование собственных бактерий хозяина этими бактериофагов стоит отдельных исследований. Кроме того, идентификация конкретных заболеваний Caudovirales может оказаться полезным в дифференциации БК и НЯК в 10% случаев ВЗК, в которых затрудняется определение клинического фенотипа между ними. Здесь мы не наблюдаем каких-либо существенных изменений в вироме у пациентов с воспалительной болезнью кишечника в течение долгого времени, с тех пор как активность заболевания изменилась. Тем не менее, крупные когорты с более частой повторной выборкой обоих групп пациентов с ВЗК и семейные группы контроля требуются для того, чтобы более полно оценить стабильность кишечного вирома при ВЗК. Хотя ВЗК связаны с бактериальным дисбиозом, сопутствующие заболевания также связаны с изменениями в бактериальном микробиоме. Они включают в себя диабет, ожирение, меетаболические нарушения и рак (Larsen et al., 2010; Ley et al., 2005; Nicholson et al., 2012; Qin et al., 2012; Shen et al., 2010; Turnbaugh et al., 2006, 2009; Zackular et al., 2013). Наши данные показывают, что определение бактериального микробиома при этих заболеваниях, вероятно, требует одновременного анализа вирома. Более умозрителен вопрос о том, являются ли бактериальные изменения микробиома при многих заболеваниях вторичными по отношению к изменениям в количестве умеренных бактериофагов или введению бактериофагов из пищи, окружающей среды, либо посредством контакта с человеком или животным. Таким образом, данные, представленные здесь, позволяют выявить обратные связи между бактериальным микробиомом и кишечным виромом, открыть новую область исследований ВЗК и, возможно, других заболеваний, которые, как было показано, связаны с изменениями в бактериальном микробиоме.

Оригинал статьи

Перевод: Максим Рабчинский Авторская редакция: Елена Лисицына Картинки: Бросалов Владимир