Сигнальный путь WNT в нормальных и опухолевых клетках

Продолжаем разбираться в устройстве слаженной работы клеток в условиях многоклеточного организма, а именно — в передаче сигналов между клетками и внутри них. Меж- и внутриклеточные сигналы регистрируются с помощью рецепторов и обрабатываются посредством каскада тонко и изящно согласованных действий сигнальных путей, направляющих работу ядерных белков. Таким образом, существенным моментом в функционировании сигнальной трансдукции являются контроль и регуляция генной экспрессии. Активируя или подавляя активность тех или иных генов, клетка реагирует на поступающие сигналы, интегрирует их, преобразуя в требуемый клеточный ответ. Разлад регуляции или нарушение равновесия в сигнальных процессах имеют серьёзные последствия как для клетки, так и для всего организма, особенно если речь идёт о таких фундаментальных процессах, как клеточная пролиферация, дифференцировка и апоптоз. Регуляционные нарушения вызваны зачастую мутациями в протоонкогенах или генах опухолевой супрессии, что ведет к малигнизации клеток и возникновению опухоли. Сигнальный путь WNT после сигнального пути МАРК является сигнальным каскадом, в котором задействованы белки, являющиеся супрессорами опухолевого роста и онкопротеинами и часто синтезируемые мутантными по своей структуре (вследствие замены нуклеотидов в структурных генах) в клетках различных опухолей человека. Наиболее распространенной причиной развития опухолей являются мутации белков β-Catenin, АРС, Axin и WISP-3 . Путь WNT играет большую роль в развитии таких онкологических заболеваний, как колоректальный рак, рак поджелудочной железы, яичников, желудка, когда отмечается его чрезмерная активность. Также мутации белков пути WNT с довольно существенной частотой присутствуют в клетках гепатоцеллюлярной карциномы и рака предстательной железы. Кроме того, более чем в 90% всех случаев довольно редко встречающегося метапластического рака молочной железы активность пути WNT повышена. Но, так как природа часто придерживается золотой середины, то вторая крайность — отсутствие проведения сигнала по пути — также может нести угрозу. Например, в основе редкого генетического заболевания тетраамелии, известным примером которого является Ник Вуйчич — оратор, вдохновляющий своим образом жизни тысячи людей с инвалидностью, лежит мутация гена Wnt-3, приводящая к прекращению синтеза кодируемого геном белка. Сниженная активность пути WNT, вероятно, стоит не на последнем месте и в развитии болезни Альцгеймера. Общие принципы устройства и классификации путей WNT Но варианты нарушений рассмотрим чуть позже, пока обратимся к устройству и вариантам функционирования пути WNT в норме. Название сигнальному пути дал внеклеточный фактор роста, активирующий данный путь. В целом, обозначение WNT получилось в результате объединения названий двух генов-ортологов (т.е. данные гены имеются у двух отдельных видов, но происходят от одного предкового гена, который имелся у последнего общего для обоих видов предка), а именно — гена сегментарной полярности wingless (wg) плодовых мушек дрозофил и протоонкогена мышей — int-1 (позже был назван wnt-1). Мутации в гене wg ведут к появлению на свет бескрылых мушек, а вирусная активация гена int-1 превращает его в онкоген и способствует развитию у мышей рака молочной железы. В ходе исследований учёными было сделано предположение о том, что синтезируемый клетками белок Wnt принимает участие в межклеточных взаимодействиях, а в 1994 г. были идентифицированы четыре первых компонента пути WNT: белки Porcupine (Prc), Dishevelled (Dvl), GSK3 и β-Catenin. С тех пор интерес к пути WNT только увеличивался, а всё новые и новые нюансы его реализации и регуляции выясняются с каждым последующим исследованием. Эволюционно данный сигнальный каскад является очень древним. По пути WNT сигналы передаются в клетках таких представителей многоклеточных организмов, как нематоды рода Caenorhabditis, рыбки данио, амфибии рода Xenopus (шпорцевые лягушки), дрозофилы, и вплоть до позвоночных животных, включая человека . В примитивной форме путь WNT имеет место быть даже у книдарий (тип стрекающие), возникших 650 млн лет назад. Соответственно своей консервативности WNT имеет существенное влияние на важные биологические процессы в клетке. Гликопротеины семейства Wnt, выступая в роли локальных медиаторов, контролируют многие аспекты эмбрионального развития и пролиферацию клеток. К примеру, эксперименты с эмбрионами шпорцевых лягушек подтвердили предположение о том, что путь WNT ответственен за формирование дорсовентральной оси тела. Также белки Wnt контролируют самообновление клеточного состава многих зрелых тканей, что осуществляется за счёт регуляции пролиферации стволовых клеток, к которым относятся ММСК (мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки), гемопоэтические стволовые клетки и прогениторные клетки. Традиционно различают канонический и неканонические пути WNT. В обоих вариантах инициация передачи сигнала по пути происходит после связывания экстрацеллюлярного белка Wnt с рецепторами семейства Fz (frizzled), расположенными на поверхности цитоплазматической мембраны. Рецепторы этого семейства состоят из внеклеточного лиганд-связывающего домена, трансмембранного домена, «прошнуровывающего» липидный бислой несколько раз, и внутриклеточного домена; передача сигнала опосредуется через G-белок. После связывания с лигандом (им в данном случае является белок Wnt) происходит ассоциация рецептора с ГДФ-связывающей формой тримерного G-белка. Вследствие происходящих конформационных изменений ГДФ диссоциирует, тримерный G-белок распадается на несколько субъединиц: Gα-субъединица связывает ГТФ и объединяется с белками-мишенями, тем самым активируя их. Специфический ответ на конкретные лиганды основан на активации соответствующей лиганду изоформы Gα-субъединицы, а также может соотноситься с повышением или понижением концентрации вторичных мессенджеров, коими для рецепторов G-белка являются циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), инозитолтрифосфат (ИФ3) и диацилглицерин (ДАГ). Возникающий после распада тримерного комплекса G-белка β-γ-димер также может обеспечивать дальнейшее проведение сигнала и активировать протоонкопротеины, как, например, PI3K. Мутации рецепторов, сопряжённых с G-белком, и самого белкового комплекса имеют место быть при раке щитовидной железы, лёгких, желудка, хотя в целом такие мутации в опухолевых клетках довольно редки. Связанные с G-белком рецепторы играют роль в возникновении и саркомы Капоши — опухоли, часто встречающейся у ВИЧ-инфицированных пациентов. В организме, инфицированном ВИЧ, когда наблюдается иммуносупрессия, эндотелиальные клетки лимфатических сосудов могут быть легко подвержены инвазии вирионов вируса герпеса 8 типа. В генетическом материале вируса содержится ген мутантного рецептора G-белка, который происходит от гомологичного клеточного рецептора. После инфицирования вирусом герпеса 8 типа и активации сигнальных путей, начинающихся с взаимодействия с рецепторами G-белка, происходит экспрессия фактора роста VEGF-A и рецепторного белка VEGFR-1. Немного отвлеклись на устройство рецепторов, вернемся в прежнюю канву повествования: канонический и неканонические пути WNT. Неканонические, в свою очередь, подразделяются на путь планарной клеточной полярности (Wnt/PCP) и путь Wnt/Ca2+. Какой из путей будет активирован — определяет соответствующая комбинация белка Wnt и Fz-рецептора, с которым белок взаимодействует. Дополнительно хочется отметить, что, вероятно, разделение канонического и неканонических путей WNT происходит на уровне внутриклеточного белка Dvl. В пути Wnt/PCP, например, после образования Dvl стимулируется запуск JNK-каскада и активация малых Rho-ГТФаз, что ведет к реорганизации актинового цитоскелета. Кроме того, существует еще два вида атипичных рецепторов из группы рецепторных тирозинкиназ, принимающих участие в направлении пути WNT - это Ror2 и RYK. Первый из них задействован в реализации неканонического пути WNT через JNK-каскад (данный сигнальный путь контролирует полярность клеток в процессе морфогенеза у Xenopus laevis). Второй рецептор образует совместно с белками Wnt и рецептором Fz тримерный комплекс и участвует в трансдукции сигнала через Dvl к ядерным белкам клетки. Всего в геноме человека известно 19 генов, кодирующих различные Wnt-факторы, и 15 генов, ответственных за разнообразные Fz-рецепторы. Классический WNT: регуляция концентрации белка β-Catenin и экспрессии целевых генов Ключевым белком классического (канонического) сигнального каскада WNT, обозначаемого как Wnt/β-Catenin, представляется протоонкопротеин β-Catenin. Стабильность и внутриклеточная концентрация данного белка регулируются в ходе реализации сигнального пути. В отсутствие Wnt-сигнала (например, если активирующие путь белки Wnt связаны с белками WIF или sFRP) β-Catenin подвергается фосфорилированию в мультипротеиновом комплексе (destruction complex), что обуславливает его дальнейшее разрушение протеасомой. В образовании мультипротеинового комплекса принимают участие белки опухолевой супрессии APC (adenomatous poliposis coli) и Axin, а также серин/треониновые киназы СК1α (casein kinase-1-alpha) и GSK-3β (glycogen synthase kinase-3 beta). Обе киназы последовательно фосфорилируют β-Catenin, к которому убиквитинлигаза β-TRCP (β-transducin repeat-containing protein) теперь может присоединить убиквитинпептиды, которые являются маркерными для протеасом, поэтому убиквитинированный β-Catenin неизбежно разрушается. β-TRCP активируется корецептором LRP5 или LRP6, активность которого, в свою очередь, сдерживается белком опухолевой супрессии Dkk (Dickkopf). Итак, поскольку β-Catenin разрушается, а его концентрация как в цитозоле, так и в ядре клетки ничтожно мала, поэтому транскрипционный фактор TCF/LEF (T-cell factor/lymphoid enhancing factor) связывается на репрессоре транскрипции, что ведёт к блокированию генной экспрессии и препятствует делению клетки. У позвоночных различают 4 гена TCF/LEF: TCF-1, LEF-1, TCF-3 и TCF-4, профиль экспрессии которых различен во время эмбрионального развития, а также и в клетках взрослого организма; по выполняемым функциям гены не являются полностью взаимозаменяемыми. Белки семейства TCF/LEF имеют N-терминальный домен для связывания β-Catenin, С-терминальный сигнал ядерной локализации (NLS, nuclear localization signal) и домен HMG (high mobility group), позволяющий белку связываться с молекулой ДНК. Связывание осуществляется в небольшой складке двойной спирали ДНК, изогнутой под углом в 90°, чем обеспечивается присоединение к молекуле ДНК и других необходимых факторов. Мотивы, с которыми связываются TCF/LEF, являются высококонсервативными и соответствуют смысловой последовательности 5’-(A/T)(A/T)CAA(A/T)G-3’. Но в случае отсутствия β-Catenin в ядре, что и происходит, когда белки Wnt не связываются с рецепторами и сигнала не поступает, белки TCF действуют в качестве репрессоров транскрипции, взаимодействуя с такими корепрессорами, как белки семейства Groucho (Grg/TLE) и белок CtBP (C-terminal Binding Protein). Белки Groucho рекрутируют гистон-деацетилазы, которые способствуют конденсации хроматина, опосредуя ингибирующий эффект на процесс транскрипции. В случае же связывания белка Wnt на Fz-рецепторе и его корецепторе LRP (low-density lipoprotein receptor-related protein), корецептор фосфорилируется посредством СК1α, затем происходит связывание цитозольного белка Dvl с рецептором Fz, а белка Axin — с фосфорилированным корецептором. Также Dvl взаимодействует с определённым участком домена белка Axin, вследствие чего комплекс, способствующий разрушению β-Catenin, дестабилизируется, и его действие инактивируется, то есть активное фосфорилирование β-Catenin прекращается. Следовательно, убиквитинирования данного белка более не происходит, и его концентрация как в цитоплазме, так и ядре повышается. В ядре β-Catenin путём связывания с несколькими белками активирует TCF/LEF и индуцирует тем самым экспрессию целевых генов, одними из важнейших продуктов которых являются активатор клеточного цикла Cyclin D1 и фактор транскрипции Myc. Схематическое представление канонического сигнального пути WNT. Клетка слева: в отсутствие сигнала Wnt происходит разрушение белка β-Catenin; транскрипция целевых генов блокируется. Клетка справа: происходит инициация сигнального пути WNT благодаря связыванию сигнального белка с рецептором и корецептором; активизация пути приводит к аккумуляции белка β-Catenin в ядре клетки, вследствие чего становится возможной экспрессия необходимых генов. Теперь остановимся чуть подробнее на механизмах регуляции промоторов целевых генов сигнального пути WNT. Как уже коротко было упомянуто выше, связывающие мотивы TCF/LEF расположены в промоторах индуцируемых к экспрессии генов, и связывание β-Catenin на TCF/LEF ведет к запуску транскрипции. Примерами такой регуляции могут быть гены c-Myc, CCND1, Conductin/Axin2. Для некоторых целевых генов пути WNT (например, PML (promyelocytic leukemia), фактор роста WISP-1) описан TCF/LEF-независимый механизм регуляции транскрипционной активности, в ходе которого β-Catenin взаимодействует с другими транскрипционными факторами или активирует базальные компоненты транскрипционного аппарата (TBP). Для регуляции WISP-1 вместо участка для связывания TCF/LEF в промоторе важен CREB-мотив (cyclic AMP response element binding protein), и β-Catenin, путем повышения концентрации цАМФ, способен индуцировать CREB-зависимую транскрипцию. Некоторые гены могут содержать в промоторе мотив для узнавания конкретным транскрипционным фактором; экспрессия таких генов регулируется непосредственным воздействием на фактор транскрипции, без прямого участия TCF/LEF. Примером такого механизма регуляции может служить простагландинсинтаза COX-2 (cyclooxygenase-2). Ген Cox-2, активируемый сигнальным каскадом WNT, опосредованно регулируется с помощью факторов транскрипции семейства PEA-3 (Polyoma virus enhancer A binding protein 3). Помимо данного способа регуляции посредством транскрипционных факторов возможна непрямая модификация генного продукта на посттранскрипционном этапе. Например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) напрямую активируется WNT, так как промотор гена содержит связывающий мотив для TCF. Но кроме того, данная прямая регуляция может быть усилена с помощью продукта гена c-Myc, специфически усиливающего трансляцию VEGF-mRNA. Говоря в целом о регуляции на разных промежутках пути WNT, нельзя не обратиться к вопросу о том, как происходит потенцирование пути в самом начале. Интересно, что существует несколько классов белков-антагонистов Wnt, которые транспортируются в межклеточное пространство и различными способами препятствуют взаимодействию белков Wnt и их рецепторов. Например, возможно связывание белком-антагонистом непосредственно белка Wnt (как действует, например, sFRP), что исключает связывание инициирующего белка с соответствующим рецептором. Также белки-антагонисты могут блокировать доступ белков Wnt к рецепторам LRP (например, Dickkopf), либо способны обрабатывать инициирующие белки протеолитически. А вот активаторов Wnt, в противоположность антагонистам, существует только один класс — это R-спондины (Rspo), гомологи которых были обнаружены только среди представителей позвоночных. Белки состоят из двух коротких, насыщенных цистеином мотивов, родственных фурин-протеазам, также имеют сходный с тромбоспондином домен и С-терминальный «хвост». По способности стимулировать клеточный ответ на сигнал Wnt R-спондины можно расположить так: Rspo2 = Rspo3 > Rspo1 > Rspo4. Соответственно этому порядку располагаются и фенотипы развивающихся организмов по степени жизнеспособности. На примере мышей это выглядит следующим образом: гомозиготные Rspo3 -/- мыши погибают в утробе вследствие неправильно сформированной плаценты; нокаутированные по гену Rspo2 мыши погибали вскоре после рождения вследствие тяжелых пороков развития легких и конечностей; выпадение генов Rspo1 и Rspo4 не имело таких серьезных последствий и мышата рождались жизнеспособными. Выключение гена Rspo1 у человека ведет к фенотипической смене пола с женского на мужской, а гомозиготная мутация в гене Rspo4 является причиной развития анонихии (отсутствие ногтевых пластин на пальцах рук и ног). Сильное положительное влияние белков Rspo на цитозольную концентрацию белка β-Catenin известно уже давно, но повышенный интерес R-спондинам начал уделяться после того, как они были отмечены в качестве незаменимого компонента для культивирования изолированных стволовых клеток. Взаимное функционирование белков Wnt и R-спондинов сдерживает дифференцировку стволовых клеток, что является крайне важным моментом при культивировании клеток в трехмерной культуре ткани. Немаловажно и то, что R-спондины имеют влияние на рост опухолевых клеток. Особо отмечено нарушение регуляции экспрессии их генов в клетках рака кишечника. Связь развития колоректального рака с нарушениями и дерегуляцией различных компонентов пути WNT Около 10% всех случаев рака толстой кишки являются семейными и развиваются из доброкачественных полипозных разрастаний эпителия толстой кишки. Наряду со спорадическим колоректальным раком различают две наследственные формы, в основе которых лежат генетические предиспозиции. Среди наследственных вариантов более частым является семейный аденоматозный полипоз, который характеризуется наличием мутации потери функции в гене АРС (adenomatous polyposis coli), кодирующем белок опухолевой супрессии. При более редком наследственном неполипозном раке толстой кишки (синдром Линча) дефекты находятся в генах-мутаторах. В 80% случаев клетки опухолей кишечника содержат мутации APC в обоих аллелях. В здоровых клетках белок АРС содействует киназе GSK-3β при фосфорилировании β-Catenin. В случае семейного аденоматозного полипоза присутствует мутация de novo (то есть мутация произошла в зародышевых клетках или в уже оплодотворенной яйцеклетке), поэтому все клетки формирующегося организма несут данную мутацию гена АРС. У других же пациентов с раком толстой кишки ген АРС, как правило, приобретает соматическую мутацию, которой поначалу обладает всего несколько клеток эпителия, выстилающего стенки толстой кишки. Клетки с подобной мутацией приобретают преимущество в росте, поскольку они пролиферируют быстрее соседних клеток (АРС опосредует аккумуляцию β-Catenin за счет дестабилизации комплекса, разрушающего этот белок, вследствие чего активация целевых генов пути WNT не прекращается), и возникают полипы, состоящие из клеток, несущих в своем геноме мутацию гена АРС. Разумеется, белок АРС является не единственным компонентом пути WNT, который изменен в опухолевых клетках. Многие типы опухолей обнаруживают мутации в гене CTNNB1, кодирующем β-Catenin. Подобные мутации препятствуют фосфорилированию этого белка или же иными способами предотвращают его разрушение, вследствие чего концентрация β-Catenin в клетке увеличивается, а путь WNT остается постоянно активным, для чего больше не требуется наличие внеклеточного сигнала от инициирующих белков; поэтому поддерживается высокий уровень клеточной пролиферации. Сигнальный каскад Wnt/β-Catenin контролирует гомеостаз в клетках слизистой оболочки кишечника. Слизистая тонкой кишки образует многочисленные ворсинки (villi intestinales), между которыми залегают Либеркюновы железы. В отделах толстой кишки слизистая оболочка представлена слоем плоского эпителия, содержащего многочисленные углубления — Либеркюновы крипты. В нижней трети крипт находятся медленно делящиеся мультипотентные стволовые клетки (МСК). Возникающие из МСК клетки-предшественники делятся временно довольно быстро и перемещаются вверх в направлении просвета. Окончательная дифференцировка клеток-предшественников осуществляется в верхней трети крипт, в результате чего могут образовываться клетки четырех типов: абсорбирующие энтероциты, секретирующие бокаловидные клетки, энтероэндокринные (энтерохромаффинные) клетки и клетки Панета . В отличие от клеток остальных типов, клетки Панета, секретирующие антимикробные соединения, мигрируют вниз, ко дну крипт, где и остаются около 20 дней. Остальные клетки по достижении верхнего края крипт подвергаются запуску программы апоптоза и слущиваются в просвет кишечника. Так происходит обновление кишечного эпителия примерно каждые 5 дней, что ориентировочно соответствует сроку, необходимому клетке для миграции со дна крипты до поверхности. В клетках кишечного эпителия в норме царит тонко настроенный баланс между процессами пролиферации, дифференцировки, миграции и апоптоза, нарушение которого создает условия для малигнизации клеток. Моделирование образования полипов с изменением крипт толстой кишки вследствие мутаций в генах АРС или β-Сatenin и дерегуляции пути WNT в сравнении с нормальным обновлением эпителиальных клеток. Пролиферация стволовых клеток, как и клеток-предшественников, индуцируется белками Wnt, синтезируемыми мезенхимальными клетками. Когда клетки-предшественник в ходе миграции достигают середины крипт, сигнал Wnt затухает и активность комплекса β-Catenin/TCF в ядре клеток снижается, вследствие чего клетка прекращает деление и приступает к дифференцировке. Комплекс β-Catenin/TCF играет роль центрального переключателя между пролиферацией и дифференцировкой клеток. Если имеются мутации компонентов пути Wnt (например, как описано выше, могут быть мутированы APC, β-Catenin), приводящие к постоянной активности данного сигнального каскада, клетка перестает зависеть от внешних сигналов Wnt. Ген c-Myc играет при этом роль важного посредника, стимулирующего пролиферацию стволовых клеток и предшественников, а также, что немаловажно, сдерживающего активность ингибитора клеточного цикла p21 CIP/WAF1 . В результате клетки-предшественники делятся, даже достигая верхнего края крипт, дифференцировки не происходит, над поверхностью гладкой слизистой оболочки появляются выросты эпителия — полипы. Напоследок хотелось бы привести наглядную модель поэтапного канцерогенеза колоректального рака. В ней первым шагом на пути к развитию злокачественной опухоли находятся мутации компонентов сигнального пути WNT, ведущие к сохранению его стойкой активности. Модель канцерогенеза рака толстой кишки, демонстрирующая превращение эпителиальных клеток, выстилающих просвет кишечника, в раковые клетки через стадии адоматозного изменения. Примечание: LOH - loss of heterozygosity (потеря гетерозиготности) Вот так изящно путь WNT реализует свои функции. Даже говорить что-то ещё в конце будет, наверное, лишним. Пусть у вас будет время просто насладиться устройством нашего организма на молекулярном уровне. Источники: Р.Б. Мак-Интайр, Г.В. Стигманн, Б. Айсман Алгоритмы диагностики и лечения в хирургии, пер. с англ. Акад. РАМН В.Д. Федорова, чл.-кор. РАМН В.А. Кубышкина, «ГЭОТАР-Медиа», 2009 C. Wagener, O. Müller Molekulare Onkologie: Entstehung, Progressing, klinische Aspekte, 2010 R.A. Weinberg The biology of cancer, Garland Science, 2014 A. Nordheim, R. Knippers Molekulare Genetik, 2015  Wnt/β-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases, Developmental Cell Review, 2009  R-spondins function as ligands of the orphan receptors LGR4 and LGR5 to regulate Wnt/beta-catenin signaling, PNAS, 2011  Structural basis of Wnt recognition by Frizzled, Sciencexpress, Research articles, 2012  Coordinating cell proliferation and differentiation, Current Opinion in Genetics & Development, 2001  The β-Catenin/TCF-4 Complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells, Cell, 2002