Методы проведения лабораторных анализов: электрофорез и иммунофиксация
Автор: Екатерина Слотина
Редакция: Елена Бреславец, Никита Чуев
Оформление: Никита Родионов
С принципом электрофореза знаком каждый студент, закончивший курс биохимии. Однако с помощью этого метода возможно исследование далеко не каждого параметра: это имеет смысл в случае определения креатинкиназы, лактатдегидрогеназы, гемоглобина и белков сыворотки крови. Таким образом можно исследовать сыворотку, плазму, мочу или ликвор.

Движение молекул в агарозном геле происходит под воздействием электрического поля. Положительно заряженные частицы движутся к катоду, а анионы, соответственно, к аноду. Скорость движения зависит от величины частиц и их заряда. Полученные в результате такого движения полосы можно окрасить, а насыщенность цвета определить методом денситометрии. Таким способом выявляются гипоальбуминемии, белки фазы острого воспаления и парапротеинемии (моноклональные гаммапатии). В других же случаях, например, для альбумина, липопротеинов и креатинкиназы, на практике используются различные иммунологические тесты и вестерн-блоттинг.

С помощью стандартного электрофореза белки можно разделить в зависимости от их радиуса, заряда и структуры. Электрофорез протеинов плазмы проводят в закрытых аппаратах при константных температурах. Однако этим методом затруднительно разделить протеины по определенному признаку, поскольку на их поведение в электрическом поле влияют все три фактора (заряд, размер и молекулярная структура белка). Именно поэтому был разработан другой метод электрофореза с использованием специального реагента — додецилсульфата натрия, SDS (sodium dodecyl sulfate). Это вещество связывается с белками, придавая им отрицательный заряд. Также при этой методике используется меркаптоэтанол, способный расщеплять все дисульфидные мостики. Таким образом заряд протеина больше не играет роли при движении белка в электрическом поле. Полиакриламид представляет собой химически инертный полимер, не несущий заряда. Можно менять концентрацию геля, тем самым регулируя размер пор в нем. Благодаря этому скорость движения белков зависит исключительно от их размера: небольшие молекулы движутся быстрее крупных, что позволяет получить в результате электрофореза видимые зоны с бо́льшей или меньшей плотностью. После окрашивания и фиксации белков на геле яркость (плотность) областей определяют с помощью денситометрических методов (от англ. density — плотность). Полученный результат представляется в виде электрофореграммы, так знакомой нам из учебников биохимии и физиологии. Стоит заметить, что результаты плотности отдельных фракций представлены не в абсолютных цифрах, а в процентах, что всегда следует учитывать при анализе полученных результатов.

Иммунонефелометрия и иммунотурбидиметрия представляют собой спектрометрические методы анализа, используемые для детекции веществ в рамках иммунологических тестов. Эти тесты являются количественными. При использовании соответствующих антител таким способом можно исследовать все существующие белки. Антигены пробы с соответствующими антителами создают трехмерные комплексы, рассеивающие свет с определенной длиной волны. Интенсивность рассеянных волн зависит от величины и количества рассеивающих частиц. Таким образом при фиксации антител на частицы латекса становится возможным улучшить иммунологический тест, увеличив сами комплексы из антигена и антител.

При турбидиметрии фиксируется как свет, отраженный от комплексов, так и тот, что прошел через раствор. При нефелометрии регистрируются только лишь сигналы от рассеянного света. Согласно оптическим законам, концентрация вещества прямо пропорциональна величине полученного сигнала. Однако закон Ламберта-Бера применим к данным методам только в том случае, если концентрации антигенов и антител эквивалентны друг другу. При сильном недостатке или избытке антител не образуется трехмерных комплексов, рассеивающих свет. Это очень важно, поскольку чаще всего лаборатории пользуются стандартными наборами для проведения подобных тестов. Если концентрация анализируемого вещества сильно превышает указанную производителем, тест дает ложноотрицательные результаты. Такие ошибки чаще всего происходят при рецидивах онкологических заболеваний, когда человек меняет место обследования и лечащего врача. На новом месте сотрудник лаборатории и не подозревает, что концентрация того или иного вещества может быть чрезмерно завышена и не фиксироваться тестом. Во избежание таких ситуаций сотрудникам рекомендуется разбавлять пробы, тестируя их при разных концентрациях с целью определения тех случаев, когда необходимо добавить нестандартное, бо́льшее количество антител. Поэтому лечащему врачу важно контролировать результаты лабораторных тестов и относиться к ним скептически, при необходимости даже позвонить сотрудникам лаборатории и попросить их провести тест заново при новых концентрациях.

Иммунофиксацию проводят после электрофореза. При этом методе применяют моновалентные и поливалентные сыворотки. Чаще всего это исследование используют для выявления моноклональных гаммапатий (моноклональные гаммапатии IgM, IgG, IgA) и протеинов Бенса-Джонса (легкие цепи иммуноглобулинов каппа и лямбда). Сыворотку крови и мочу всегда исследуют параллельно. Этот тест является качественным. После электрофореза с применением буфера (pH = 8,6) и качественного анализа пробу фиксируют на агарозном геле, инкубируют с антисыворотками, а также окрашивают. Сперва оценивают препарат сыворотки крови. При наличии в нем преципитатов иммуноглобулинов говорят о парапротеинемии.

Источники:

  1. Dörner K. Klinische Chemie und Hämatologie: 69 Tabellen;[Taschenlehrbuch]. – Georg Thieme Verlag, 2009.
  2. Renz H. (ed.). Praktische Labordiagnostik: Lehrbuch zur Laboratoriumsmedizin, klinischen Chemie und Hämatologie. – Walter de Gruyter, 2014.