Гранулоциты

Врождённый иммунитет реализуется посредством деятельности многих видов клеток. Главная роль в этом процессе принадлежит клеткам миелоидного ряда. К ним относятся большая часть лейкоцитов крови, за исключением лимфоцитов. Все клетки проходят единый путь миграции из красного костного мозга в общий кровоток и оттуда в периферические ткани, с той лишь разницей, что для одних клеток кровь является пулом, где они постоянно циркулируют для обеспечения адекватного и своевременного ответа; а для других кровь представляет собой лишь транзитный пункт, откуда они поступают в ткани. Как уже говорилось, все клетки крови происходят из красного костного мозга, а родоначальником являются гемопоэтические стволовые клетки, которые можно разделить на три стадии развития: стволовые клетки длительного действия, стволовые клетки короткого действия, мультипотентные родоначальные клетки. Уже на 2-й и 3-й стадии появляется маркёр, использующийся в качестве идентификации стволовых клеток — CD34. Проходя коммитирование (ограничение возможных путей дифференцировки), то есть становясь клетками общего лимфоидного и миелоидных предшественников, они приобретают маркёр CD38. Клеток, несущих маркёр CD34, всего около 0,5-5 %, из них только 1–10% могут быть рассмотрены в качестве стволовых клеток, т.к. не несут CD38.

Клетки врождённого иммунитета развиваются из трёх линий дифференцировки. Первая линия, гранулоцитарно-макрофагальная, или GM-линия, даёт начало моноцитарной (М-линия) и гранулоцитарной (G-линия). Другие две линии, ответственные за развитие эозинофилов и базофилов, до конца не изучены. Скорее всего они развиваются из одной предковой клетки, которая впоследствии дифференцируется на эозинофильную и базофильную линии. Традиционно выделяют несколько этапов развития клеток врождённого иммунитета: миелобласты, промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты, палочкоядерные и сегментоядерные (зрелые) формы. Последние две в норме циркулируют в периферическом кровотоке, хотя в некоторых ситуациях, например, при тяжёлом воспалении, могут наблюдаться единичные метамиелоциты, что всё же скорее стоит рассматривать как физиологический процесс, приобретающий черты патофизиологического.Любые клетки, в том числе и миелоидные, для своего роста и развития требуют набор определённых белков - факторов транскрипции.

Связываясь с определёнными последовательностями ДНК, чаще промоторами, они обеспечивают экспрессию генов необходимых для дальнейшей дифференцировки. Чаще всего с промотором взаимодействует не один белок, а целый комплекс факторов транскрипции, состоящий из конституциональных, постоянно присутствующих, и индуцируемых. Для каждой стадии развития клеток характерен свой набор факторов транскрипции.

Так, клетки миелоидной линии, в отличие от лимфоидной, не чувствительны к фактору транскрипции Ikaros, в тоже время фактор PU.1 является одним из основополагающих для развития клеток GM-линии. Хотя главным цитокином для всей миелоидной линии, ответственным за её выживание, считается гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и в некоторой степени IL-3, по мере созревания и продвижения к дифференцированным формам всё большее значение приобретают линейно-специфические цитокины: для моноцитов — моноцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), для нейтрофилов — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF). Для развития эозинофилов похожую роль играет IL-5. [1]

GM-CSF впервые был идентифицирован в лёгочной ткани мышей после инъекции липополисахарида благодаря его способности стимулировать пролиферацию клеток костного мозга in vitro и генерировать колонии как гранулоцитов, так и макрофагов.
GM-CSF продуцируется различными типами клеток, включая макрофаги, тучные клетки, Т-клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки главным образом в ответ на иммунную стимуляцию цитокинами, которые опосредуют воспаление. В этих клетках бактериальные эндотоксины и воспалительные цитокины, такие как IL-1, IL-6 и TNFα, являются мощными индукторами GM-CSF. В нормальных условиях GM-CSF в кровообращении находится в низкой или даже необнаруживаемой концентрации, которая может повышаться до высоких уровней в процессе иммунного ответа.

В течение последних 20 лет исследования GM-CSF ясно продемонстрировали, что всякий раз, когда GM-CSF чрезмерно экспрессируется, это всегда ведёт патологическим изменениям. Ранние исследования с использованием трансгенных мышей показали, что избыточная экспрессия приводит к накоплению макрофагов, слепоте и тяжелым повреждениям различных тканей. Избыточная экспрессия GM-CSF в желудке приводит к аутоиммунному гастриту. Индукция гена GM-CSF, опосредованная аденовирусом, в легких приводила к тяжелым легочным эозинофилиям. Эта информация позволила предположить, что GM-CSF может играть центральную роль в стимулировании сенсибилизации к аэроаллергенам. Также достойным внимания является предположение, что полиморфизм гена GM-CSF человека является вероятным детерминантом астмы. Пациенты с ревматоидным артритом, которые получают GM-CSF для коррекции нейтропении после химиотерапии онкологических заболеваний, могут страдать от ухудшения ревматоидного заболевания. [3]

Нейтрофилы находятся в костном мозге около 1-2 суток и выходят в кровоток уже зрелой, можно сказать старой клеткой, лимитированной к индукции экспрессии генов деления и синтеза белков. Длительность нахождения миелоидных клеток в костном мозгу, кровотоке и периферических тканях.

Выход лейкоцитов из костного мозга в кровоток происходит вследствие ослабления взаимодействия хемокинов, выделяемых стромальными клетками костного мозга, с рецепторами лейкоцитов. Наиболее важный хемокин, удерживающий клетки в костном мозгу, — CXC12 (SDF-1 — Stroma derived factor 1, фактор стромальных клеток 1). Под влиянием колониестимулирующих факторов происходит снижение экспрессии генов хемокинов и соответственно их выработка, а так же происходит подавление экспрессии их рецепторов. Всё это делает возможным выход созревших клеток в периферический кровоток. Механизм экстравазации лейкоцитов осуществляется по тем же механизмам, что и при воспалительных реакциях, с той лишь разницей, что происходит это не столь интенсивно. Нейтрофилы, базофилы и эозинофилы рекрутируются из кровотока в ткани в чрезвычайных ситуациях (острое воспаление, аллергические процессы). [1]

Нейтрофилы

Генерация нейтрофилов костном мозге происходит непрерывно, за сутки может производство может достигать 2×10¹¹ клеток. Как уже говорилось, процесс контролируется гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF), который синтезируется в ответ на цитокин Т-клеток интерлейкин-17A (IL-17A). IL-17A, в свою очередь, контролируется IL-23, синтезируемым резидентными макрофагами и дендритными клетками. Процесс апоптоза нейтрофилов со временем подавляет синтез IL-23 и таким образом уменьшает стимуляцию G-CSF.

Зрелые нейтрофилы имеют средний диаметр 7-10 мкм, ядро ​​сегментировано, а цитоплазма обогащена гранулами и секреторными везикулами. Три типа нейтрофильных гранул образуются последовательно во время миелопоэза в стадии промиелоцитов и заполнены провоспалительными белками. Это азурофильные (первичные) гранулы, которые содержат миелопероксидазу, специфические (вторичные), содержащие лактоферрин и желатиназные (третичные) гранулы, которые содержат матриксную металлопротеиназу 9 (MMP9, также известную как желатиназа B).

Азурофильные гранулы содержат широкий набор гидролаз и других ферментов, активных при кислых значениях рН: миелопероксидазу, α-фукозидазу, 5’-нуклеотидазу , β-галактозидазу , арилсульфатазу , α-маннозидазу , N-ацетилглюкозаминидазу, β-глюкуронидазу, кислую глицерофосфатазу , лизоцим (мурамилидазу), нейтральные протеазы (серпроцидины) — катепсин G, эластазу, коллагеназу, азурацидин, а также дефензины, кателицидины, лактоферрин, гранулофизин, кислые гликозаминогликаны и другие вещества. Специфические гранулы содержат ферменты, проявляющие свою активность при нейтральных и слабощелочных значениях рН: лактоферрин, щелочную фосфатазу, лизоцим, а также белок BPI, связывающий витамин В12. Маркерами этой разновидности гранул служат лактоферрин и мембранная молекула CD66. В специфических гранулах содержится большое количество фермента NADPН-оксидазы, катализирующего «кислородный взрыв» и образование активных форм кислорода — главных факторов бактерицидности. [1]

Существование нескольких типов гранул можно объяснить тем, что некоторые из белков не могут существовать вместе в нативной форме, например, нейтрофильная эластаза гидролизирует связанный с нейтрофильной желатиназой липокалин (NGAL). Нейтрофилы также содержат легко мобилизуемые секреторные везикулы, которые могут быстро включаться в мембрану нейтрофила. Таким образом, при активации нейтрофилов секреторные везик улы сначала переносят молекулы, необходимые для клеточной адгезии (например, интегрины β2), к поверхности нейтрофилов, далее высвобождаются гранулы желатиназы, которые могут лизировать базальную мембрану и/или внеклеточный матрикс.

В большинстве тканей каскад рекрутинга лейкоцитов включает в себя следующие общепризнанные этапы: краевое стояние, роллинг (Rolling), стадия слабой адгезии (Adhesion), стадия сильной адгезии (Crawling) и, наконец, трансмиграцию (Transmigration).

Нейтрофильный рекрутинг инициируется изменениями на поверхности эндотелия, являющимися результатом стимуляции воспалительными медиаторами (гистамин, лейкотриены и цитокины), которые высвобождаются из резидентных тканевых лейкоцитов, когда они вступают в контакт с патогеном. Эндотелиальные клетки могут также быть активированы непосредственно рецепторами опознавания паттерна (PRR); в течение нескольких минут они регулируют предварительно синтезированный P-селектин из телец Вайбеля — Паладе. E селектин синтезируется de novo в течение 90 минут. Эти два селектина имеют частично перекрывающиеся функции и максимизируют вербовку нейтрофилов. После того как они оба презентовались на поверхности эндотелия, они связываются с гликозилированными лигандами (PSGL1) нейтрофилов, что приводит к захвату и краевому стоянию свободно циркулирующих нейтрофилов и их последующего роллинга вдоль сосуда. Хотя основная роль L-селектина, по-видимому, связана с миграцией лимфоцитов в лимфатические узлы, экспрессия L-селектина циркулирующими нейтрофилами может облегчить их вторичную привязку к нейтрофилам, находящимся уже в стадии роллинга. Роллинг требует быстрого образования и разрушения адгезивных связей. Для обеспечения плавного ролинга диссоциация лиганд-рецепторной связи P-селектин-PSGL1 в задней части клетки должна быть сбалансирована образованием другой связи на передней кромке. Для того, чтобы выйти из сосуда, нейтрофилы должны сначала пересечь эндотелий, что занимает около 2-5 минут, а затем базальную мембрану, что занимает больше времени, 5-15 минут. Трансмиграция требует интегринов и молекул адгезии семейства САМ (ICAM1, ICAM2, VCAM1, PECAM1, он же CD3, CD99,JAM-молекулы, молекулы адгезии эпителиальных клеток ECAM и многие другие молекулы эндотелиальных клеток с не до конца выясненными функциями.

Прохождение через слой эндотелиальных клеток происходит либо парацеллюлярно (между эндотелиальными клетками), либо трансцеллюлярно (через эндотелиальную клетку). Парацеллюральный процесс требует разрыва межклеточных белковых связей кадгерином. Нейтрофилы предпочтительно выбирают парацеллюлярный путь, но также используют трансцеллюлярный, хотя последний менее эффективен и занимает 20-30 минут. Эндотелиальная базальная мембрана представляет собой непрерывную структуру, состоящую из белков экстрацеллюлярного матрикса (ECM), включая коллагены и ламинины. Нейтрофилы содержат специфические гранулы, такие как MMP (матриксная металлопротеиназа), желатиназы или сериновые протеазы (например, нейтрофильная эластаза), которые обладают ферментативной активностью в отношении молекул ECM. Несмотря на соблазн заключить, что нейтрофил «разрезает» свой путь через базальную мембрану, до настоящего времени ни генетическое, ни фармакологическое блокирование не продемонстрировали и не подтвердили это.

Если протеазы не играют существенной роли в экстравазации нейтрофилов, как мигрирующие клетки проходят через базальную мембрану эндотелия? Гистологические исследования не выявили дефектов и разрывов в структурах базальных мембран в очагах воспаления. Некоторые исследования, показали, что нейтрофилы преимущественно мигрируют через области базальной мембраны, которые демонстрируют низкие уровни молекул ECM (плотностью менее 60% относительно соседних участков). Эти менее плотные области базальной мембраны содержали меньшее количество таких белков, как коллаген IV, ламинин 10 и нидоген 2, но не перлекан.

Нейтрофилы могут элиминировать патогены несколькими путями, как внутриклеточными, так и внеклеточными. Когда нейтрофилы сталкиваются с микроорганизмами, они фагоцитируют их, инкапсулируя в фагосомы; затем происходит их непосредственное уничтожение с использованием NADPH-кислородзависимых механизмов (активные формы кислорода) или антибактериальных белков (катепсины, дефенсины, лактоферрин и лизоцим). Эти белки могут высвобождаться из нейтрофильных гранул либо в фагосомы, либо во внеклеточную среду.

Высоко активированные нейтрофилы могут элиминировать микроорганизмы, высвобождая внеклеточные ловушки нейтрофилов (NETs). NETs состоят из элементов ядра, к которому относятся нити ДНК, гистоны, белки (например, лактоферрин и катепсины) и ферменты (нейтрофильная эластаза), которые высвобождаются из гранул нейтрофилов. NETs обездвиживают патогены, тем самым предотвращая их распространение, а также способствуя последующему фагоцитозу захваченных микроорганизмов.

Данный механизм был изучен на мышах, которые получили интраперитонеальную инъекцию ЛПС. Были обнаружены репрезентативные компоненты NETs (гистонов) с антителами. NETs могут оставаться связанными с нейтрофилам, которые их дегранулировали; также есть сообщения, что подобные внеклеточные ловушки образуют и другие гранулоциты (тучные клетки и базофилы) и даже макрофаги образуют ловушки в присутствии либо Staphylococcus aureus, либо Mannheimia haemolytica. Недавно было показано, что при сепсисе, вызванном кишечной палочкой Escherichia coli, NETs были в четыре раза эффективнее в связывании бактерий нежели клетки Купфера, а блокирование синтеза NETs приводило к появлению отдалённых очагов отсева E.coli. Способность таких ловушек работать была документально подтверждена в отношении многих микроорганизмов, в том числе грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов, вирусов и простейших, однако спорным остаётся вопрос о возможности NETs непосредственно уничтожать патогенные микроорганизмы. [4]

Эозинофилы

Эозинофилы являются ещё одними клетками врожденного иммунитета, которые появляются в эволюционной истории уже у ранних позвоночных. Эозинофилы составляют небольшую часть клеток крови (у человека 0,5–2% от числа лейкоцитов). В крови они циркулируют меньше суток (от 30 мин до 18 ч), после чего мигрируют в ткани и находятся там в течение 10–12 сут. Зрелые эозинофилы представляют собой крупные клетки (18–20 мкм в диаметре) с сегментированным (двудольным) ядром. Они содержат крупные (до 1 мкм) эозинофильные гранулы. Человеческие эозинофилы содержат гранулы, которые содержат четыре катионных белка: главный основной белок 1 (MBP1, также известный как MBP и PRG2), ответственный за эозинофильность гранул, эозинофильный катионный белок (ECP, также известный как RNase3), эозинофильный нейротоксин (EDN, также известный как RNase2) и эозинофильная пероксидаза (EPX, также известный как EPO).

Известно, что количество эозинофилов в крови и некоторых тканях увеличивается во время специфических иммунных реакций, включая реакцию хозяина на гельминтозы и аллергические заболевания. Эозинофилия связана с иммунным ответам, опосредованным Th-2, включая продуцирование IL 5, что усиливает эозинофилопоэз и активацию эозинофилов. Поэтому исходя из их способности дегранулировать и высвобождать свои катионные белки, которые, как было показано, убивают гельминты in vitro, предположили, что эозинофилы развивались в процессе эволюции в качестве клеток, обеспечивающих защиту от гельминтов. Однако многочисленные исследования, в том числе у мышей с дефицитом или наоборот с переизбытком эозинофилов (IL5-трансгенных), показали, что существуют некоторые нюансы функций эозинофилов.

Множество экспериментальных моделей гельминтной инфекции продемонстрировали, что эозинофилы не проявляют никаких защитных свойств. Более того, многоклеточные гельминты, развившись вместе со своими хозяевами, могут даже извлечь выгоду из присутствия эозинофилов: например, в случае инкапсулированных в мышечной ткани личинок трихинелл, цитокины, продуцируемые эозинофилами (включая IL 10 и IL 4), подавляют ответ хозяина, который был бы токсичным для этих личинок. Таким образом, теория, что опосредованные эозинофилами иммунные реакции в ответ на паразитов являются полезными для хозяина, и что ассоциированные с эозинофилами аллергические заболевания являются лишь нежелательным побочным эффектом, должна быть пересмотрена. [2]

В качестве клеток врожденной иммунной системы эозинофилы являются источниками широкого спектра цитокинов. Для МВР и ЕСР характерна токсичность в отношении гельминтов, обусловленная способностью этих молекул встраиваться в мембрану гельминтов. ECP и EDN обладают активностью РНКазы, что может говорить об их роли в противовирусной защите. Все эти белки могут сами по себе быть токсичными для организма. Также стоит отметить, что у тканевых форм имеются в наличии мелкие гранулы, содержащие ферменты (кислая фосфатаза, арилсульфатаза, пероксидаза), и первичные гранулы, содержащие кристаллы Шарко–Лейдена, в основе которых лежит липофосфолипаза. Можно ещё отметить липидные тельца, которые имеют все необходимое для синтеза эйкозаноидов: арахидоновую кислоту, липоксигеназу и циклоксигеназу. Таким образом, эозинофилы все чаще признаются в качестве участников иммунного ответа и гомеостаза. [1]

Базофилы

Базофилы представляют собой наименее распространенную популяцию гранулоцитов, которая составляет около 1% лейкоцитов. Первоначально они были обнаружены в 1897 году немецким ученым Полом Эрлихом, и только спустя почти сто лет было доказано, что базофилы связывают иммуноглобулин E и высвобождают гистамин. После этих результатов базофилы считались избыточной популяцией клеток, которые просто имитировали тучные клетки. Однако последующие исследования, которые непосредственно изучали функции базофилов и тучных клеток, показали, что эти популяции миелоидных клеток отличаются набором поверхностных маркеров, ультраструктурным фенотипом, факторами, необходимыми для терминальной дифференцировки, высвобождением медиаторов воспаления.

Значительные успехи в понимании биологии базофилов совпали с развитием двух репортёрных моделей мыши по генам IL-4/eGFP и обнаружением того, что тучные клетки, базофилы и эозинофилы приобретают конститутивную экспрессию мРНК IL-4 во время их развития. Эти исследования позволили легче идентифицировать базофилы с помощью проточной цитометрии, что привело к всестороннему анализу профиля поверхностный маркёров и генной экспрессии.Методы подавления базофилов как в физиологических, так и в воспалительных состояниях были разработаны с использованием антител, нацеленных на высокоаффинный IgE-рецептор или мембранный гликопротеин CD200R3. Возможность идентифицировать и подавлять популяции базофилов у мышей позволила провести ряд исследований, которые привели к значительным достижениям в понимании функций базофилов.

В частности, появилась теория о центральной роли базофилов в развитии Th2 цитокин-зависимого ответа и воспаления. [5] Главная морфологическая особенность базофилов — наличие у них большого количества базофильных гранул (10–150 на клетку). Гранулы разновидностей тучных клеток варьируют по составу, однако они всегда содержат вазоактивные амины, главный из которых — гистамин — реализует значительную часть эффектов тучных клеток при аллергических реакциях. Кроме того, в гранулах содержатся хондроитинсульфаты А и С и/или гепарин, а у некоторых видов животных (например, у кроликов) — серотонин. В состав гранул входят также ферменты, прежде всего протеазы, а также дегидрогеназа, пероксидаза, РНКаза, гистидинкарбоксилаза и кислые гликозамингликаны. Выделяют 3 группы протеаз тучных клеток: триптазы (ферменты со специфичностью, близкой к трипсину), химазы (сходны по специфичности с химотрипсином) и карбоксипептидазу А (относится к металлопротеиназам). Перекрестное cвязывание рецепторов FcεRI комплексами IgE-антител с аллергенами обусловливает дегрануляцию и проявление всех основных реакций гиперчувствительности немедленного типа. Гранулы после выброса регенерируют.

Тучные клетки несут некоторые патоген-распознающие рецепторы (TLR-2, TLR-3, TLR-4), что позволяет им распознавать патогены и их продукты напрямую. При стимуляции тучные клетки синтезируют и секретируют эйкозаноиды и цитокины. Из эйкозаноидов в тучных клетках в наибольшем количестве вырабатываются лейкотриен С4 и простагландин E2. Спектр цитокинов, секретируемых тучными клетками, сходен со спектром цитокинов, продуцируемых Т-хелперами 2-го типа. Спектр секретируемых цитокинов (особенно спонтанная выработка IL-4) определяет иммунорегуляторную функцию тучных клеток, главное проявление которой, как уже говорилось, — участие в индукции дифференцировки Th2-клеток.[1]

Источники