Навигатор по дорогам генома: методы микроскопии помогают заполнять пробелы в представлениях о внутреннем мире клетки
Наследственный материал, содержащийся в каждой из 1013 клеток человеческого организма, охватывает невероятно огромное количество генетической информации. Для того, чтобы данная информация могла быть специфически прочитана, фактор транскрипции должен найти определенное место и связаться с ним.
Пути, которыми следует фактор транскрипции, и взаимодействия, в которые он на этих путях вступает, еще недостаточно тщательно исследованы. Возможно, некоторые техники микроскопии привнесут немного света в эти потемки.
Одна из методик, которая уже продвинула в свое время клеточную биологию далеко вперед — флуоресцентная микроскопия. Для усовершенствования данного метода физик Ernst Stelzer предложил LSF-метод микроскопии (Light Sheet Fluorescence Microscopy). Освещается не полностью вся клетка, а только область около 2 мкм, и это делает возможным наблюдать только те белки, которые находятся в данный момент в данном месте. Передвижением освещаемой зоны можно получить четкие пространственные фотографии клетки. Таким образом, становится возможным представление передвижений белков в пространстве и времени.
Молекулярные карты передвижений
Многие биологические процессы возможны только благодаря спонтанному случайному передвижению атомов и молекул (сюда можно отнести и нахождение белком участка связывания на ДНК, а также взаимодействие энзимов с маленькими молекулами в клетке и запуск ими процессов обмена веществ). Уже в 1970-х годах существовала методика, позволяющая измерить случайные передвижения молекул и статистически проанализировать их — флуоресцентная корреляционная микроскопия (FCS). Огромный минус данного метода наблюдений и измерений в то, что флуоресцентная корреляционная микроскопия способна зарегистрировать всю пробу только точка за точкой. Чтобы создать целую карту передвижений какой-либо молекулы необходимо о 50 до 100 подобных точек, что потребует около четверти часа для измерений. Однако живые клетки способны перенести только весьма ограниченное время облучения лазером, иначе они будут необратимо повреждены. И данная проблема находит свое решение в комбинировании LSF-микроскопии и флуоресцентной корреляционной микроскопии. Комбинирование было реализовано учеными Jan Krieger и Jan Buchholz. Данная комбинация методов микроскопии дает также возможность наблюдать, как две помеченные различными флуоресцирующими веществами молекулы взаимодействуют между собой.
Приведу небольшое исследование.
После прослеживания за передвижениями ламина (белок ядерной оболочки, образующий сети внутри ядра) и хроматина с помощью LSFM-FCS, было наглядно показано, что ламин связан с хроматином не только на периферии у оболочки, но и внутри ядра. Эластичность образованных ламином сетей существенно способствует стабильности генома, поскольку в клетках с недостатком ламина движение хроматина было значительно замедлено. Для многих клеточных процессов участки генома, расположенные на достаточном удалении друг от друга, должны взаимодействовать между собой, и биологическая функция ламина — ускорять эти взаимодействия.
С помощью измерений FRET (ферстеровский перенос энергии) в 2001 году было впервые установлено пространственное расположение выдающейся из нуклеосомы ДНК (которое несколько отличалось от предполагаемого до этого). Также было показано, что модификация гистонов влияет на структуру нуклеосом.
В перспективе FRET — путь к визуализации отдельных молекул, что имеет важнейшее значение для диагностики и терапии многих заболеваний, в методах которых еще много неясностей, которые необходимо устранить. В частности, успехи генной терапии, омраченные явлениями инсерционного мутагенеза, подчеркивают, тем не менее, сложность системы внутренней регуляции экспрессии генов, что делает последствия введения векторных систем с генными копиями непредсказуемыми, а подробные процессы, ведущие к включению или выключению того или иного гена, все еще ускользающими из-под контроля.
Источники:
