Трансгенные мыши: у истоков brave new world

«…Вот здесь у нас инкубаторы. Он открыл теплонепроницаемую дверь, и взорам предстали ряды нумерованных пробирок – штативы за штативами, стеллажи за стеллажами – недельная партия яйцеклеток. Хранятся, – продолжал он, – при 37 градусах; что же касается мужских гамет, – тут он от крыл другую дверь, – то их надо хранить при тридцати пяти». Где это мы? Может быть, дивный новый мир уже наступил, а может быть, мы просто в лаборатории. С тех пор, как Хаксли явил свету свою антиутопию, наука необратимо изменилась, а арсенал ученых пополнился методами, позволяющими совершать немыслимые ранее вмешательства в само естество природы. Приведет ли прогресс науки к разделению общества на касты на молекулярном уровне, и будут ли студенты изучать бокановскизацию неизвестно, но как бы там ни стало в будущем, опыт прошлого говорит о том, что открытия в мире науки и ее развитие раз за разом давали человечеству новые возможности, изменяя представления людей о жизни. Например, множество знаний о функциях наших генов были получены благодаря экспериментам, проведенным в стенах лабораторий. Использование клеточных культур, а также манипуляции генами в рамках модельных организмов – крыс и мышей – позволяют ученым предполагать и проверять функциональные особенности генов на организменном уровне (обратная генетика). В частности, благодаря исследованиям, поставленным при участии лабораторных животных, были установлены гены, способствующие опухолевому росту, а также определены различные генные мутации, ведущие к изменениям физиологических процессов в организме, который является носителем мутации. Пробуя выключать те или иные гены, либо, наоборот, вызывать их гиперэкспрессию, и наблюдая за реакциями организма, ученые смогли выявить функции не одной тысячи генов, а также определили взаимосвязь многих генетических дефектов и вызываемых ими нарушений. Возможность переносить действие исследуемых генных мутаций на модельный организм и изучать его в реальном времени открыла ученым путь к более глубокому понимаю влияния дефектов генетического материала, а также позволила разрабатывать методы терапии генетически обусловленных заболеваний. Это ли не прекрасно?

Корректирующие вмешательства в генетический материал лабораторных животных осуществляются на ранних стадиях эмбрионального развития, причем вмешательство это может быть различного рода: например, в какой-либо участок генома может быть произведено встраивание нового гена (развивающаяся из эмбриона мышь обозначается как трансгенная); если некий интересующий нас ген мыши будет определенным образом модифицирован у эмбриона, то мышь будет обозначаться как „knock-in“ или „knock-out“ (в зависимости от того, усиливается или подавляется экспрессия данного гена, соответственно). Некоторые более сложные линии трансгенных мышей, характеризующиеся клеточноспецифической регулируемой генной экспрессией и претерпевшие сразу несколько генетических модификаций, выводятся при спаривании мышей отдельных линий (compound transgenic).

Чтобы поместить в геном клеток мыши новый ген, можно прибегнуть к ретровирусным векторным системам или микроинъекции интегрируемого гена в оплодотворенные ооциты (в пронуклеус, эмбриональные стволовые клетки). Внесенная ДНК, достигая ядра клетки, встраивается в геном в случайном месте. После инъецирования ДНК эмбрионы вынашиваются самками, а после появления на свет последующих поколений внедренные мутации отслеживаются с помощью ПЦР и блот-гибридизации. Чтобы определить, находится ли внесенный трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь можно скрестить с другой мышью. Например, если эмбриональные стволовые клетки взять от мышей гомозигот по гену, ответственному за черный цвет шерсти и ввести в бластоцисту мыши-альбиноса, а родившихся химерных мышей скрестить впоследствии с мышами-альбиносами, можно легко выявить гетерозигот по цвету шерсти. Скрещивание таких мышей между собой поможет получить в последующих поколениях чистые линии трансгенных мышей.

Ретровирусные векторы

Эффективность доставки генов в составе ретровирусных векторов заключается в известной способности ретровирусов встраивать свой геном в геном инфицированных клеток. Вносимый с помощью вирусного вектора участок ДНК защищен с двух сторон длинными терминальными повторами (long terminal repeats, LTR), которые, кроме прочего, кодируют информацию об упаковке и экспрессии вирусной РНК. В клетках вспомогательных линий вирусная РНК запаковывается в вирусную оболочку, и после центрифугирования вирус легко выделить и очистить из супернатанта. После получения вируса мышиные эмбрионы инфицируют в течение 2-4 дней. РНК вируса переписывается обратными транскриптазами для построения на ее основе ДНК, которая, как правило, по прошествии первого или второго деления зиготы интегрируется в геном. Таким образом, инфицированные вирусом эмбрионы состоят из нескольких клеточных популяций – клеток, в геном которых интегрирован трансген, и клеток, в которых интеграции чужеродного участка ДНК не произошло. Ориентировочно через 6 недель после рождения потомства первого поколения, эти мыши спариваются. И только после того, как зародышевые клетки этих мышей также получают трансген, он может быть переда потомству следующего поколения и так далее. Таким образом, всех этих потомков можно будет отнести к одной трансгенной линии мышей. Изначально ретровирусные векторы применялись для выявления исключительно функционально важных генов, которые, например, уничтожались или инактивировались при интеграции вирусного генома, после чего проводился анализ трансгенных животных, которые отбирались по возникшими аномалиям. Уничтоженный/инактивированный ген должен был быть впоследствии индентифицирован, чтобы установить, какова же генетическая предпосылка развившейся аномалии. Также необходимо было понимать, какой фенотип лежит в основе той или иной аномалии – представлен ли трансген в гомо- или же в гетерозиготном состоянии.

Микроинъекции

Помимо векторных транспортных систем, полученных на основе ретровирусов, доставка мини-генов может быть произведена в виде микроинъекции в оплодотворенные ооциты. Введенные мини-гены точно так же интегрируются в случайных местах генома клеток зиготы. Преимуществом инъекции в пронуклеус является то, что величина вносимого гена не ограничена, как в случае ретровирусных векторов, размером вирусной оболочки. Обычно мини-гены производятся при участии E.coli и представляют собой единицы, состоящие из промотора, синтетического интрона, кодирующего региона гена, представляющего интерес, и терминатора транскрипции.

Для осуществления инъекции ооциты извлекаются из организма самки-донора. Но прежде, за пару дней до спаривания донорные женские особи получают интраперитонеальные инъекции сыворотки беременных мышей, и в день спаривания индуцируется процесс суперовуляции за счет дополнительной стимуляции введением хорионического гонадотропина. За счет создаваемого гормонального фона количество ооцитов увеличивается с 5-8 до 40. На следующий день после спаривания оплодотворенные ооциты изолируют из организма самки-донора, проводя процедуру промывания яйцевода. В только-только оплодотворенных ооцитах после внедрения сперматозоидов их пронуклеус не сливается с ядром яйцеклеток, пока процесс их мейотического деления не завершится образованием женского пронуклеуса. Кстати, на этой стадии мужской пронуклеус легко можно различить, глядя в световой микроскоп. Соответственно, микроинъекция осуществляется сразу после выделения ооцитов от донорской мыши. Яйцеклетку фиксируют на капилляре и тоненькой инъекционной пипеткой микроманипулятора в мужской пронуклеус вводится 1-2 пл раствора ДНК, содержащей мини-ген. После этого презиготы выдерживают в культуре и только после начала деления зиготы производят ее имплантацию, подсаживая мыши-акцептору, которая предварительно была спарена со стерильным самцом, что необходимо для успешной нидации. И после всех приложенных усилий, надо сказать, только 0-15% новорожденных мышат будут трансгенными (в зависимости от умельцев, проводивших процедуру).

Что ж, несмотря на то, что получение трансгенных мышей путем микроинъекции ДНК сейчас довольно рутинная процедура, тем не менее, существуют определенные проблемы, которые ученые решают каждый свой рабочий день, постоянно совершенствуя свои навыки и применяемые методики. И хочется верить, что эти труды не напрасны. Ведь каждая таблетка, прописанная вам лечащим врачом, когда-то была проверена на каком-нибудь модельном трансгенном животном, чтобы сегодня вы чувствовали себя лучше, чтобы ваша болезнь не помешала вам сделать то, что вы задумали.

Источники:

• M. Wink Molekulare Biotechnologie: Konzepte, Methoden und Anwendungen, Wiley-VCH, 2011
• M.H. Hofker, J. van Deursen Transgenic Mouse: Methods and Protocols, 2003