Новые стратегии для редактирования генома в клетках мозга
Перевод: Koyaanis Katsi
Редакция: Михаил Повиленский
Оформление: Cornu Ammonis

Несмотря на беспрецедентные терапевтические возможности редактирования генома, в настоящее время целительная сила этого метода ограничена значительной сложностью доставки ферментов, режущих ДНК, в клетки, которые нуждаются в коррекции. Недавнее исследование показало, что ферменты, редактирующие геном, можно доставить в клетку в виде комплексов рибонуклеопротеинов. Таким образом удалось добиться полного излечения синдрома ломкой Х-хромосомы (FXS) в модели на мышах.

Технология редактирования генома преобразила биомедицинские исследования и продемонстрировала многообещающие терапевтические возможности благодаря своей успешности на культурах тканей, ex vivo, редактировании генома эмбрионов и в моделях болезней человека на животных. Для успешного внедрения в клинику метод редактирования генома должен быть безопасным, эффективным, и в идеале — простым в изготовлении. Эффективную доставку кодирующей ДНК и белковых компонентов геном-редактирующего фермента на основе CRISPR, такого как Cas9, могут осуществлять аденоассоцированные вирусы (AAV), однако безопасность этого метода сомнительна, а производственные расходы достаточно велики [1]. Одной из новых альтернатив является доставка ферментов, редактирующих геном, в форме предварительно собранного рибонуклеопротеинового комплекса (РНК и белка, он же RNP). Этот подход весьма привлекателен из-за малой продолжительности действия: RNP разрушаются менее чем за 24 часа. Вирусы же, напротив, могут способствовать длительной (в течение нескольких дней) экспрессии фермента, редактирующего геном, что связано с более высокой частотой неожиданных побочных эффектов [2]. Для обеспечения транспортировки RNP из цитоплазмы в ядро обычно используется клеточный сигнал внутриядерной локализации (nuclear localization signal, NLS), однако особую проблему представляет перенос крупного геном-редактирующего фермента из внеклеточного пространства в цитоплазму. Для улучшения переноса Cas9-RNP в клетку применяется несколько успешных стратегий, таких как модификация белка Cas9 с включением последовательностей NLS, спонтанно разрушающих мембраны [3] или добавление к белку Cas9 отрицательно заряженных доменов для улучшения его взаимодействия с полимерами, способствующими внедрению в клетку [4]. Лаборатория Мёрти (The Murthy lab) разработала подход под названием CRISPR-Gold, в котором структурообразующая наночастица золота, конъюгированная с одноцепочечной ДНК, используется для привлечения Cas9-RNP, покрытых катионным полимером, облегчающим проникновение через клеточную мембрану [5].

Головной мозг — заманчивая область для применения терапевтического редактирования генома, поскольку он анатомически изолирован, что обеспечивает прямой хирургический доступ, а также иммунопривилегирован, что снижает риски, возникающие при введении вирусных векторов [1] и/или ферментов, редактирующих геном [6]. В недавнем исследовании, проведённом при сотрудничестве лабораторий Ли (Lee) и Мёрти [7], в мозг мыши при помощи CRISPR-Gold были успешно доставлены фермент Cas9 и его аналог Cas12a (Cpf1). CRISPR-Gold, несущий либо Cas9, либо Cas12a, стереотаксически вводили в гиппокамп или полосатое тело мозга мыши, где фермент эффективно осуществлял редактирование генома, что определялось с помощью флуоресцентных репортеров. Для экспериментов по изучению способности редактирования генома излечивать аутизм применялась основанная на нокауте Fmr1 мышиная модель FXS. FXS — это распространенное наследственное моногенное расстройство аутистического спектра (РАС), в случае которого медикаментозная терапия в значительной степени неэффективна. Важно отметить, что перспективным кандидатом для редактирования выступает ген mGluR5, поскольку он может способствовать развитию FXS, а также других РАС. Чтобы проверить, может ли ослабление экспрессии mGluR5 уменьшить степень проявления ассоциированных с аутизмом фенотипов в модели FXS, в полосатое тело мозга мышей вводили комплекс CRISPR-Gold, несущий Cas9-RNP, нацеленный на mGluR5. В обработанных клетках полосатого тела оказались повреждены 15 % локусов mGluR5, что приводило к снижению количества мРНК или белка mGluR5 на 40 % (подтверждено методом количественной ПЦР или иммуноокрашивания, соответственно). Исследования поведения мышей, на которых проводилось редактирование FXS, выявили заметное урежение частоты двух основных поведенческих особенностей мышей с аутичными фенотипами: закапывания шариков и спонтанных прыжков. Этот многообещающий результат был подкреплен наблюдением, что терапия CRISPR-Gold не оказала заметного влияния на двигательную активность мышей.Другие тесты на токсичность показали, что терапия CRISPR-Gold не приводит к гибели клеток in vivo или изменению свойств нейронов в культуре.

Результаты терапии CRISPR-Gold нагляднее оценивать в сравнении с AAV-опосредованной доставкой, которую пионеры редактирования генома быстро приспособили для применения на головном мозге (Рис. 1). Доставка Cas9/AAV, то есть AAV, кодирующего Cas9 и его одноцепочечной направляющей РНК (single guide RNA), оказалась особенно успешной для создания моделей нейродегенеративных заболеваний и других болезней головного мозга и нервной системы. В докладе 2016 года, лаборатория Жанг (Zhang) сообщила о Cas9/AAV-опосредованном редактировании гена MCP2 в головном мозге мышей, что привело к полному нарушению его экспрессии в большинстве (68 %) клеток ткани, в которую была произведена инъекция. Полученное устойчивое распределение вирусов по всей ткани и редактирование в постмитотических нейронах позволило создать на мышах модель синдрома Ретта с соответствующим поведенческим фенотипом [8]. Также AAV применяется в терапевтических моделях; например, в лаборатории Дэвидсона (Davidson laboratory) отредактировали болезнетворный аллель в модели хореи Гентингтона на трансгенных мышах — после инъекции Cas9/AAV в головной мозг уровень мутантного белка гентингтина снизился на 80 % [9]. В одной из недавних публикаций показана успешность аналогичного подхода для редактирования in vivo мутантных аллелей гена APP, который обусловливает развитие болезни Альцгеймера, еще одного заболевания с доминантным типом наследования [10]. Векторы Cas9/AAV вводили в гиппокамп трансгенных взрослых мышей, экспрессирующих множественные копии мутантного аллеля APP человека и избирательные инсерции/делеции (1,3 %), создаваемые в мутантном аллеле при редактировании, позволили снизить уровень патогенного бета-амилоида в мозге мышей [10]. Ни в одном из примеров редактирование болезнетворных мутаций методом Cas9/AAV не привело к улучшению состояния (фенотипа) мышей, в отличие от заметного улучшения при терапии методом CRISPR-Gold в недавнем исследовании Ли с соавт. Однако в различных исследованиях применяются различные модельные системы, и логично было бы ожидать, что эффективность редактирования методом Cas9/AAV может оказаться сопоставимой с редактированием, применявшимся на модели FXS.

Рисунок 1. Доставка геном-редактирующего фермента Cas9 в клетки мозга с помощью CRISPR-Gold или аденоассоциированного вируса (AAV).
Cas9 можно ввести в мозг в форме интактного рибонуклеопротеинового комплекса (пурпурный) с CRISPR-Gold (слева) или в виде ДНК-инструкций (зеленый), «упакованных» в вектор, например, AAV. CRISPR-Gold содержит наночастицу золота (желтый), дополненную одноцепочечной ДНК (синий), которая направляет Cas9; все компоненты покрыты катионным полимером (черный), облегчающим проникновение в клетку. При вирусной доставке доступ к внутренней части клетки обеспечивают белки капсидов (серый), а после внедрения в клетку происходит транскрипция и трансляция «упакованной» ДНК и синтез РНК и белковых компонентов, составляющих Cas9.

Одним очевидным преимуществом AAV-опосредованной доставки в случае мышей и приматов является распространение вирусных частиц по всему мозгу. При изолированном введении RNP [3] или же CRISPR-Gold [7], напротив, редактированию подвергаются лишь клетки в пределах нескольких кубических миллиметров от места инъекции. Это указывает на потенциальные препятствия для внедрения метода в терапевтическую практику. Ещё одна потенциальная проблема, связанная с применением CRISPR-Gold для лечения людей — это введение тяжёлого металла, который, как известно, токсичен. Однако эта проблема облегчается тем, что золото составляет лишь незначительную долю наночастиц, и тем, что в идеале редактирование генома — лечение однократное, что позволит избежать накопления золота, возможного при повторных инъекциях. При продолжении разработки, доставка RNP может стать основной стратегией для терапевтического редактирования генома клеток головного мозга.

Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl+Enter.