Нарушение выработки IFN-I и ответ воспалительных моноцитов и макрофагов вызывают летальную пневмонию у мышей, зараженных SARS-CoV
Перевод: Дмитрий Кремлёв
Редакция: Елена Попова, Koyaanis Katsi
Оформление: Cornu Ammonis, Никита Родионов
Публикация: 18.06.2020
Последнее обновление: 20.06.2020

Ключевые моменты

— Коронавирус SARS-CoV вызывает летальную респираторную инфекцию у линии мышей BALB/c.

— Стойкая репликация SARS-CoV и отсроченная передача сигнала от IFN-I способствуют развитию заболевания.

— IFN-I вызывает миграцию патогенных воспалительных моноцитов и повышение проницаемости кровеносных сосудов.

— Степень тяжести заболевания снижается при отсутствии передачи сигнала от IFN-I.

Теоретическое обоснование

Высокопатогенные возбудители респираторных коронавирусных инфекций человека вызывают острое летальное заболевание, которое характеризуется избыточной воспалительной реакцией и повреждением легких. Однако факторы, приводящие к патологии легких, остаются не совсем изученными. На мышах, зараженных коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV), авторы демонстрируют, что стойкая репликация вирусов сопровождается отсроченной передачей сигнала от интерферона I типа (IFN-I), который контролирует воспалительные реакции и иммунопатологические процессы в легких при снижении выживаемости.

IFN-I обнаруживается до тех пор, пока титры вирусов не достигнут пика, однако раннее введение IFN-I улучшает течение патологических иммунных реакций. Отсроченный сигналинг IFN-I способствует накоплению патогенных воспалительных моноцитов и макрофагов, что приводит к повышению уровня цитокинов/хемокинов, увеличению проницаемости кровеносных сосудов, нарушению механизма вирус-специфического Т-клеточного ответа. Модифицирование ДНК с целью нарушения экспрессии гена рецепторов IFN-αβ (IFNAR) или деплеция воспалительных моноцитов и макрофагов защищает мышей от летальной инфекции, без влияния на вирусную нагрузку. Эти результаты показывают, что IFN-I и воспалительные моноциты и макрофаги способствуют развитию летальной инфекции, вызванной SARS-CoV, и являются потенциальными терапевтическими мишенями при лечении пациентов, зараженных коронавирусом и, возможно, иными респираторными вирусами.

Результаты

Ингибирование передачи сигнала от IFN-I снижает заболеваемость и летальность у мышей линии BALB/c, инфицированных SARS-CoV

Чтобы изучить, усугубляет ли передача сигнала от IFN-I течение тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС), авторы инфицировали мышей линии BALB/c в возрасте 7–9 недель, а также мышей, нокаутных по гену рецептора IFN-αβ (далее эта линия обозначается Ifnar⁻ᐟ⁻) летальной дозой SARS-CoV (3×10⁴ БОЕ). Отслеживалась тяжесть заболевания. У мышей линии BALB/c наблюдались: сильная вялость, взъерошенная шерсть, сгорбленная поза и затрудненное дыхание уже на третий день после заражения; все это сопровождалось прогрессирующим снижением веса. Примерно 85 % мышей умерли на восьмой день (рис. 1А–1С). Однако мыши линии Ifnar⁻ᐟ⁻ пережили заражение, имея лишь умеренную (приблизительно 15 %) потерю веса и легкую и умеренную клиническую форму болезни (рис. 1A–1C). Даже при более высоких дозах вируса (10⁵ БОЕ) все мыши Ifnar⁻ᐟ⁻ выжили. Мыши линии BALB/c среднего возраста (8–9 месяцев) высоко восприимчивы к SARS-CoV, но даже у этих мышей выживаемость увеличивалась при отсутствии передачи сигнала от IFN-I.

Рисунок 1 | Передача сигнала от IFN-I способствует развитию патологии легких, сопровождающую инфекцию SARS-CoV с летальным исходом
А и В. Процент от начального веса (А) и процент выживаемости (В) мышей, зараженных SARS-CoV.
С. Клинические показатели, определяемые на 3 и 5 день после инфицирования.
D. Титры SARS-CoV в легких, определяемые с помощью анализа бляшкообразующих единиц (н/о — не определено).
Е. Макропрепараты легких на 3 и 5 дни после инфицирования.
F. Микроскопические изменения в легких незараженных мышей и на 5 день после инфицирования.
G и H. Кривые веса (G) и выживаемости (H) мышей, зараженных SARS-CoV, получавших антитела к рецептору IFNAR и контрольные изотипические антитела (MOPC21).

Данные являются репрезентативными для 2–3 независимых экспериментов с 4–5 мышами в группе.
Данные в (А), (С) и (D) представлены ± стандартная ошибка среднего (SEM).
*p < 0,05, **p < 0,01, и ***p < 0,001.
Результаты гистопатологических исследований и исследований макропрепаратов получены от 4–5 мышей в группе.

Суммарные вирусные нагрузки в тканях легких были одинаковыми у молодых мышей BALB/c и Ifnar⁻ᐟ⁻ во все дни после заражения, за исключением небольшого увеличения на третий день у Ifnar⁻ᐟ⁻ (рис. 1D). SARS-CoV был полностью выведен из легких этих мышей к десятому дню (рис. 1D). Общее обследование легких показало обширную гиперемию и венозное полнокровие в легких у группы мышей BALB/c на третий и пятый день, в то время как у группы Ifnar⁻ᐟ⁻ результаты были почти что нормальными (рис. 1E). Гистопатологическое исследование легких показало, что выраженный альвеолярный отек, десквамация бронхиального эпителия и утолщение междольковых перегородок в легких у мышей BALB/c наблюдались на пятый день, в то время как в группе Ifnar⁻ᐟ⁻ альвеолярный отек сопровождался минимальной перибронхиальной и периваскулярной лимфоплазмоцитарной инфильтрацией (рис. 1F). Острое повреждение легких, ассоциированное с ТОРС, часто сопровождается накоплением богатой белками жидкости в периваскулярном и альвеолярном пространствах (Franks с соавт., 2003; Gu с соавт., 2005; Nicholls с соавт., 2003). Для оценки повышения проницаемости сосудов, авторы оценили экстравазацию синего красителя Эванса в легких на пятый день. У мышей BALB/c, зараженных SARS-CoV, проницаемость сосудов в легких была значительно выше, однако у Ifnar⁻ᐟ⁻ она была гораздо ниже.

Поскольку эти результаты предполагают значимую роль передачи сигнала от IFN-I при тяжелом течении заболевания, аномалии развития также могут привести к улучшению результатов при отсутствии передачи сигнала от IFNAR. Чтобы исключить эту возможность, исследователи либо блокировали рецепторы IFN-αβ (IFNAR) у мышей линии BALB/c, либо давали им вместо лечения изотипические контрольные антитела до и после заражения SARS-CoV. В соответствии с проявлениями болезни у линии Ifnar⁻ᐟ⁻, лечение антителами к IFNAR значительно сократило потерю веса и повысило выживаемость по сравнению с мышами, которые получали контрольные антитела (рис. 1G и 1H).

Для определения общего характера вышеуказанных результатов авторы инфицировали линии BALB/c и Ifnar⁻ᐟ⁻ вирусом гепатита мышей (MHV-1), вирусом гриппа A (IAV, штамм PR8) и двумя РНК-вирусами, которые также вызывают у мышей острые респираторные заболевания. В соответствии с результатами предыдущих исследований (Cervantes-Barragan с соавт., 2009; Seo с соавт., 2011), передача сигнала от IFN имеет критическое значение для защиты от инфекции: все мыши линии Ifnar⁻ᐟ⁻ погибли от полулетальной инфекции MHV-1 и штамма гриппа PR8, в то время как только приблизительно 10 % MHV-1 и 20 % PR8-инфицированных мышей BALB/c, соответственно, умерли. Эти результаты свидетельствуют, что существуют уникальные особенности инфекции, вызываемой SARS-CoV, из-за которых передача сигнала от IFN-I является скорее патологической, а не защитной.

Быстрая репликация SARS-CoV и отсроченная экспрессия IFN-I в легких

Результаты предыдущих исследований (Frieman и соавт., 2010; Roberts и соавт., 2007; Zhao и соавт., 2009) и результаты, показанные на рис. 1D, демонстрируют быструю скорость репликации SARS-CoV в легких. Как показано на рис. 2A, титры вируса практически максимальны через 16 часов первого дня после заражения. Иммуногистохимическое исследование легких, инфицированных SARS-CoV, выявило репликацию вируса в дыхательных путях и паренхиме легких. Окрашивание вирусного антигена обнаруживалось в пневмоцитах II типа через 16 часов первого дня (рис. 2B). К 24 и 48 часам были обнаружены вирусные антигены, распределенные по дыхательным путям и паренхиме легких, с более интенсивным распространением антигенов в пневмоцитах II типа и с менее — в пневмоцитах I типа (рис. 2B), аналогично результатам исследования биоптатов людей, зараженных SARS-CoV (Gu и соавт., 2005; Nicholls и соавт., 2003). Распределение и количество клеток, содержащих вирусные антигены, были одинаковыми у мышей линий BALB/c и Ifnar⁻ᐟ⁻ в соответствии с титрами вируса, показанными на рис. 2A.

Рисунок 2 | Характеристика репликации вируса и продукции IFN-I в легких, инфицированных SARS-CoV
А Титры вируса в легких, определяемые в ранний период после заражения.
B
Иммуногистохимическое исследование N-протеина SARS-CoV в разное время после заражения.
C
Уровни цитокинов/хемокинов в БАЛЖ мышей линий BALB/c и Ifnar −/− в разное время после инфицирования.
D
Кривые веса и выживаемости после терапии IFN-β (2000 U, интраназально, разовая доза в 6, 12 или 24 час после инфицирования).
E
Вирусная нагрузка в легких в 1 и 3 день после инфицирования у мышей, получавших IFN-β (2000 U, 6 часов после инфицирования) или натрий-фосфатный буфер (phosphate buffered saline, PBS).
F
Легочные клетки, изъятые у мышей на 24 час после инфицирования SARS-CoV, были отсортированы с помощью метода иммуномагнитной сепарации (MACS) на Siglec-H-положительные и отрицательные и на Siglec-F-положительные и отрицательные клетки.
Отобранные клетки анализировали на уровни мРНК IFN-α4 и IFN-β.
G
Иммуногистохимическое исследование экспрессии IFN-β в дыхательных путях легких (верхняя панель) и паренхимы легких (нижняя панель) в разное время после инфицирования (С).

Данные (А) и (С)-(Е) получены в результате двух независимых экспериментов, 4–5 мышей в группе на 1 эксперимент. Данные в пунктах (А) и (С)-(F) представлены ± стандартная ошибка среднего (SEM).
**p < 0,01, ***p < 0,001.

IFN-I важен для запуска защитного иммунного ответа, но он не был обнаружен в бронхоальвеолярной лаважной жидкости мышей (БАЛЖ) группы BALB/c до 24 часов первого дня после заражения. Аналогичным образом, другие цитокины и хемокины, вовлеченные в иммунный ответ, также показали отсроченную экспрессию при анализе БАЛЖ (рис. 2C). Напротив, у линии Ifnar⁻ᐟ⁻ значительно снизился уровень цитокинов и хемокинов в БАЛЖ по сравнению с линией BALB/c (рис. 2C). Поскольку отсроченная экспрессия медиаторов воспаления может способствовать избыточной реакции клеток врожденного иммунитета, далее авторы изучили, может ли введение IFN-I до пика вирусной репликации изменить клинические проявления и увеличить выживаемость. С этой целью исследователи вводили рекомбинантный IFN-β (2000 U) интраназально в разное время после заражения. В соответствии с предыдущими исследованиями (Kumaki с соавт., 2011) IFN-I, введенный на 6 час первого дня до пика репликации вируса, но не на 24 час первого дня, полностью защищает мышей от потери веса и развития заболевания. Введение IFN-β на 12 час первого дня приводит к промежуточному уровню защиты. (рис. 2D), а при введении на 6 час умеренно снижает вирусные титры в легких в первый день (рис. 2E).

Далее авторы исследовали клеточный источник IFN-I в легких, инфицированных SARS-CoV. Поскольку плазмоцитоидные дендритные клетки (пцДК) и альвеолярные макрофаги (АМ), как известно, являются важными источниками IFN-I при заболеваниях, ассоциированных с РНК-содержащими вирусами (Killip с соавт., 2015), исследователи предварительно очистили ткани от пцДК и альвеолярных макрофагов, имеющих поверхностные белки Siglec-H и Siglec-F соответственно (метод магнитной сепарации). Затем уровни мРНК IFN-β и IFN-α4 измерены методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией. Белок Siglec-H экспрессируется пцДК и субпопуляциями макрофагов в лимфоидных тканях, но главным образом, легочными пцДК (Swiecki и соавт., 2014). Очищенные плазмоцитоидные ДК инфицированных мышей демонстрировали значительно более высокие уровни мРНК IFN-β и IFN-α4 в сравнении с клетками, которые не содержат белок Siglec-H (рис. 2F). В соответствии с этими результатами, человеческие пцДК также являются постоянными источниками IFN после заражения SARS-CoV in vitro (Cervantes-Barragan и соавт., 2007). Альвеолярные макрофаги также вырабатывали IFN-I, но не более, чем другие клетки. Кроме того, авторы также окрашивали участки тканей на IFN-β для оценки содержания IFN-I в других легочных клетках и обнаружили экспрессию в клетках дыхательных путей и интерстициальных клетках (рис. 2G). В совокупности эти результаты позволяют предположить, что многие типы клеток, но особенно пцДК, экспрессируют IFN-I при заражении вирусом SARS-CoV у мышей и, скорее всего, у людей.

Сигналинг IFN-I регулирует миграцию и активацию моноцитов и макрофагов. Затем исследователи оценили, способствовал ли IFN-I миграции клеток врожденного иммунитета у мышей, зараженных SARS-CoV. Общее количество нейтрофилов, альвеолярных макрофагов, естественных киллеров и пцДК в легких сравнили у мышей, зараженных SARS-CoV, у линий BALB/c и Ifnar⁻ᐟ⁻ в первый и третий день. Произошло значительное увеличение количества клеток, содержащих лимфоцитарный антиген Ly6С в большом количестве и интегрин CD11b (далее этот клеточный фенотип обозначаются Ly6ChiCD11b+), в легких мышей популяции BALB/c, и это увеличение прекращалось при отсутствии передачи сигнала от IFN-I (рис. 3A и 3B). На третий день произошло примерно шестикратное увеличение инфильтрации клетками Ly6ChiCD11b+ легочной ткани у мышей BALB/c по сравнению с мышами Ifnar⁻ᐟ⁻ (рис. 3B). Фенотипическое исследование показало, что эти клетки экспрессировали CCR2 (рецептор β-хемокинов), F4/80 (макрофагальный маркерный протеин) и CD11, но не белок Ly6G и лектин Siglec-Н. Это значит, что эти клетки были моноцитами и макрофагами (рис. 3С). Кроме того, уровни CD69 (раннего антигена активации T-лимфоцитов), BST-2 (тетерина), белков CD80 и CD86 были значительно выше на поверхности моноцитов и макрофагов, взятых из легких мышей BALB/c в сравнении с мышами линии Ifnar⁻ᐟ⁻ (рис. 3D), что соответствует большей активации клеток. Хемокины CCL2, CCL7 и CCL12, которые являются лигандами для рецептора CCR2, также как и ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), участвуют в миграции воспалительных макрофагов и моноцитов (Shi and Pamer, 2011; Song и соавт., 2015). В то время как экспрессия CCR2 в легких мышей Ifnar⁻ᐟ⁻ значительно уменьшалась в течение 24 и 72 часов после заражения в сравнении с мышами BALB/c, экспрессия ГМ-КСФ замедлилась на 16 час. При прямом измерении ex vivo CCL2 продуцировался преимущественно моноцитами и макрофагами, а передача сигнала от IFN-I была достаточной для того, чтобы вызвать экспрессию лиганда к CCR2 клетками костного мозга. Таким образом, сигналинг IFN-I способствовал накоплению высокоактивированных воспалительных моноцитов и макрофагов в легких, зараженных SARS-CoV, и этот процесс усиливался моноцитами и макрофагами посредством выработки лигандов к CCR2.

Рисунок 3 | IFN-I способствует накоплению провоспалительных моноцитов и макрофагов
A Графики FACS (метод сортировки клеток с активированной флуоресценцией) показывают кинетику накопления воспалительных моноцитов фенотипа Ly6ChiCD11b+ в легких.
В
Процент и общее число клеток Ly6ChiCD11b+ в легких.
С
 Экспрессия фенотипического маркера на воспалительных моноцитах из легких мышей BALB/c на 3 день после инфицирования.
D Уровни маркеров активации клеток на поверхности макрофагов и моноцитов легких на 3 день.
E Общее количество цитокин-положительных макрофагов и моноцитов в легких, определенное после 7-часовой инкубации ex vivo c добавлением брефельдина A.

Данные получены из 2–3 независимых экспериментов с 4 мышами в группе на 1 эксперимент.
Данные в (В), (D) и (Е) представлены ± стандартная ошибка среднего (SEM).
*p < 0,05, **p < 0,01, ***p <0,001.

ДПИ — день после инфицирования

TNF — фактор некроза опухоли
ВМиМ — воспалительные моноциты и макрофаги

Чтобы определить, были ли моноциты и макрофаги также ответственны за повышенную экспрессию провоспалительных цитокинов, были окрашены моноциты и макрофаги мышей BALB/c и Ifnar⁻ᐟ⁻ ex vivo на наличие внутриклеточных TNF, IL-6, IL-1-β и NO-синтаз. В результате были выявлены значительно более высокие процентные доли и числа клеток, выделявших эти провоспалительные цитокины в легких мышей BALB/c по сравнению с Ifnar⁻ᐟ⁻ (рис. 3E). Далее авторы оценили, являются ли моноциты и макрофаги главным источником этих цитокинов в зараженных легких путем деплеции клеток с помощью моноклонального антитела к рецептору CCR2 (мАТ МС21), поскольку CCR2 экспрессируется в особенности при высоких концентрациях провоспалительных моноцитов (Mack с соавт., 2001). Антитело MC21 обеспечивает специфическую деплецию макрофагов и моноцитов фенотипа Ly6ChiCD11b+, снижая их уровень у мышей линии Ifnar⁻ᐟ⁻. Лечение моноклональными антителами МС21 значительно снижает уровни CCL2, TNF, и IL-6 в бронхоальвеолярной лаважной жидкости. Это напрямую подтверждает, что моноциты и макрофаги являются главным источником цитокинов/хемокинов в инфицированных легких.


Деплеция моноцитов и макрофагов улучшает течение заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV

Для непосредственного установления связи между повышенной инфильтрацией легочной ткани макрофагами и моноцитами и иммунопатологией легких, вызванной SARS-CoV, исследователи вызвали деплецию этих клеток с помощью моноклонального антитела MС21. Этот метод лечения защитил от летального исхода при инфекции, что подтвердило решающую роль моноцитов и макрофагов в повышении заболеваемости и смертности, индуцированных вирусом SARS-CoV (рис. 4А). Для подтверждения этих результатов еще одной когорте мышей было введено антитело против белка BST-2, так как он на высоком уровне экспрессировался активированными моноцитами и макрофагами (рис. 3D). BST-2 конститутивно экспрессируется на плазмоцитоидных дендритных клетках и его количество увеличивается на моноцитах, макрофагах и некоторых стромальных клетках при наличии воспалительных стимулов (Blasius и соавт., 2006). Деплеция BST-2 полностью защищает мышей линии BALB/c от летального исхода, в то время как около 70 % мышей группы, получавшей лечение контрольными иммуноглобулинами, умерли (рис. 4С). Деплеция моноцитов и макрофагов или введение антител минимально повлияли на титры вируса в легких (приблизительно в 2 раза) (рис. 4B и 4D). Гистологическое исследование легких, обработанных MC21 или моноклональными антителами к BST-2, показало уменьшение альвеолярного отека и десквамации бронхиального эпителия без изменения клеточной инфильтрации, по сравнению с группами мышей, которые получали контрольный иммуноглобулин (рис. 4E). Кроме того, деплеция моноцитов и макрофагов также уменьшает проницаемость сосудистой стенки. Примечательно, что терапия антителами MC21 также уменьшила количество пцДК в легких, даже если они не экспрессировали рецептор CCR2, возможно, за счет уменьшения выработки хемокинов. Как отмечалось выше, моноциты и макрофаги экспрессируют высокие уровни воспалительных цитокинов (рис. 3E), что приводит к повышению их уровня в легких (рис. 2C), что также может способствовать более тяжелому течения заболевания у мышей линии BALB/c. В соответствии с этим, нейтрализация одного провоспалительного медиатора, TNF, который был наиболее повышен у группы мышей BALB/c в сравнении с группой Ifnar⁻ᐟ⁻ (рис. 3E), обеспечила частичную, но, тем не менее, существенную защиту по сравнению с контрольной группой мышей (рис. 4F). Хотя эти результаты демонстрируют ключевую роль моноцитов и макрофагов при тяжелой форме заболевания у мышей, инфицированных SARS-CoV, нейтрофилы часто наносят вред при респираторных вирусных инфекциях (Brandes и соавт., 2013). Однако, как отмечалось выше, у мышей линии BALB/c немного выше количество нейтрофилов немного выше и их деплеция не повлияла на выживаемость (рис. 4G). В совокупности эти результаты демонстрируют роль моноцитов и макрофагов на нескольких стадиях воспалительного процесса, что приводит к иммунопатологическим изменениям у мышей, зараженных SARS-CoV.

Рисунок 4 | Деплеция воспалительных моноцитов повышает выживаемость при летальной инфекции, вызываемой SARS-CoV
Выживаемость и патологию легких определяли у молодых мышей линии BALB/c, получавших терапию деплецией воспалительных моноцитов и макрофагов или контрольными антителами.

A и C.
Кривые веса и выживаемости мышей, инфицированных SARS-CoV, после терапии контрольными антителами, MC21 (A) или антителами к BST-2 (C).
B и D.
Вирусные титры в легких в 1 и 3 день после контрольного Ig и MC21 (B) или лечение моноклональными антителами к BST-2 (D).
E.
Гистологические изменения в легких незараженных, получавших лечение изотипическими антителами, деплецией макрофагов и моноцитов у мышей линии BALB/c, зараженных SARS-CoV, на 5-й день.
F.
Кривые веса и выживаемости контрольной группы и группы BALB/c, получавших антитела к TNF-α
G.
Выживаемость мышей BALB/c, инфицированных SARS-CoV, после деплеции нейтрофилов.

Данные являются репрезентативными для 2 независимых экспериментов (4–5 мышей в группе на 1 эксперимент).
Данные в (A)–(D) представлены ± стандартная ошибка среднего (SEM).
*p < 0,05, **p < 0,01,***p < 0,001.

Передача сигнала от IFN-I к гемопоэтическим клеткам усиливает течение болезни у мышей BALB/c, инфицированных SARS-CoV

Выявив ключевую роль ВМиМ в усугублении тяжести SARS-CoV, авторы оценили нужен ли сигналинг IFN-I к гемопоэтическим и не гемопоэтическим клеткам для инициации миграции ВМиМ к месту инфекции.
Для решения этой задачи авторы создали химеры костного мозга между разрозненными CD45 у мышей BALB/c и Ifnar⁻ᐟ⁻. Приживление донорских клеток было подтверждено проточным цитометрическим анализом экспрессии CD45.1 и CD45.2 на лейкоцитах периферической крови через 5 недель после пересадки (рис. 5А). Через 6 недель после восстановления костного мозга химерные мыши столкнулись с летальной дозой SARS-CoV. Только 10 % мышей в группе Ifnar⁻ᐟ⁻→ Ifnar⁻ᐟ⁻ и 20 % мышей в группе Ifnar⁻ᐟ⁻→BALB/c скончались. Напротив, 100 % мышей группы BALB/c→BALB/c и ∼70 % мышей-химер группы BALB/c→ Ifnar⁻ᐟ⁻ погибли от SARS-CoV (рис. 5B). Относительная восприимчивость мышей с химерным костным мозгом к инфекции SARS-CoV коррелировала с количеством ВМиМ, проникающих в легкие на 3 день заражения (рис. 5C и 5D). Таким образом, у мышей BALB/c с восстановленным костным мозгом, наблюдалась повышенная инфильтрация ВМиМ, тогда как мыши, получившие Ifnar⁻ᐟ⁻ костный мозг, в основном были устойчивы к SARS-CoV (рис. 5С и 5D). Вместе эти результаты показывают, что сигналинг от IFN-I, в основном к кроветворным клеткам, способствовал развитию иммунопатологии легких у мышей BALB/c, зараженных SARS-CoV.

Рисунок 5 | Передача сигнала от IFN-I на гемопоэтические клетки увеличивает SARS-CoV-индуцированную заболеваемость и смертность
А. Мононуклеарные клетки периферической крови из костного мозга химерной мыши (через пять недель после трансплантации костного мозга) исследованы методом проточной цитометрии для оценки приживления трансплантата костного мозга.
В.
 Выживаемость химерных мышей отслеживалась после заражения SARS-CoV (103 БОЕ интраназально, 4–5 мышей в группе, 2 независимых эксперимента).
С.
Анализ инфильтрации суспензии легочных клеток химерных мышей, инфицированных SARS-CoV, воспалительными моноцитами и макрофагами на третий день после заражения.
D.
Проценты и общее число воспалительных моноцитов и макрофагов на третий день после инфицирования.

Для (С) и (D) данные репрезентативны для 2–3 независимых экспериментов (2–3 мыши в группе на эксперимент). Данные в (D) представлены в виде ± стандартная ошибка среднего (SEM).

*p < 0,05, **p < 0,01, и ***p < 0,001.

IFN-I-опосредованные воспалительные реакции нарушают вирус-специфический T-клеточный ответ у мышей BALB/c, зараженных SARS-CoV

Так как для элиминации SARS-CoV необходим устойчивый Т-клеточный ответ (Channappanavar и соавт., 2014; Zhao и соавт., 2010), была проведена его оценка на шестой день у зараженных мышей групп BALB/c, Ifnar⁻ᐟ⁻ и у тех мышей, которым вводили моноклональное антитело MC21. Общее количество вирус-специфических Т-клеток двух субпопуляций — CD8 (эпитоп S366) и CD4 (эпитоп N353) — в легких было значительно меньше у мышей группы BALB/c по сравнению с группой Ifnar⁻ᐟ⁻ или теми мышами, что проходили лечение антителом MC21 (рис. 6A-6D). Предыдущие исследования ассоциировали субоптимальный Т-клеточный ответ с нарушением миграции дендритных клеток дыхательных путей (ДКДП) в лимфатические узлы для дальнейшей антиген-специфической пролиферации (Zhao и соавт., 2011, 2009). Поэтому для изучения того, способствовало ли уменьшение миграции дендритных клеток субоптимальному вирус-специфическому Т-клеточному ответу, подопытным животным обеих групп (BALB/c и Ifnar⁻ᐟ⁻) за 6 часов до инфицирования SARS-CoV интраназально вводили 6-карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (6-​Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE). Проанализирована миграция дендритных клеток в лимфатические узлы на 18 час после заражения. Несмотря на то, что процент мигрировавших CFSE-положительных клеток был ниже у мышей Ifnar⁻ᐟ⁻, было получено сходное число таких клеток и в группе мышей BALB/c, и в группе Ifnar⁻ᐟ⁻ (рис. 6E и 6F). Эти результаты свидетельствуют, что нарушения Т-клеточного ответа не влияют на слабую миграцию дендритных клеток дыхательных путей.

Рисунок 6 | Передача сигнала от IFN-I нарушает Т-клеточный ответ
На 6 день был зафиксирован Т-клеточный ответ в легких у мышей линий BALB/с, Ifnar −/−, зараженных SARS-CoV, и у мышей BALB/c, получавших терапию крысиным IgG и антителами MC2.

A и B. Графики FACS (A) и гистограммы (B) показывают процентное и общее число вирус-специфических CD4 и CD8 Т-клеток в легких мышей группы BALB/c и Ifnar −/−.
С и D.
 Графики FACS (С) и гистограммы (D) показывают процентное и общее число вирус-специфических CD4 и CD8 Т-клеток в лёгких мышей линии BALB/c, получавших терапию крысиным Ig и антителами MC21.
E и F.
 Суспензии клеток медиастинальных лимфатических узлов приготовлены и исследованы на 18 час после инфицирования для на наличие дендритных клеток дыхательных путей, меченных CFSE. Показаны репрезентативные графики FACS (Е), а также процентные показатели и общее число клеток (F).
G и H. Процент апоптотических T-клеток субпопуляций CD4 и CD8 в легких, зараженных SARS-CoV, на 17 день. Показаны репрезентативные гистограммы (G) и процент апоптотических Т-клеток (H).

Данные репрезентативны для 2 независимых экспериментов (4–5 мышей/группа/эксперимент). Данные в пунктах (В), (D), (F) и (H).
представлены ± стандартная ошибка среднего (SEM).
*p < 0,05, **p < 0,01, и ***p < 0,001.
См. также дополнительный рисунок S5 в оригинале статьи.

Поскольку известно, что IFN-I сенсибилизирует Т-клетки к апоптозу (Carrero и соавт., 2004; Welsh и соавт., 2012), авторы измерили уровень апоптоза Т-клеток у зараженных мышей BALB/с и Ifnar⁻ᐟ⁻. Как показано на рис. 6G и 6H, более высокий процент апоптоза среди всех Т-клеток субпопуляций CD8 и CD4 был у инфицированных мышей линии BALB/c. Для исследования возможных механизмов Т-клеточного апоптоза был измерен уровень Fas и DR5 — рецепторов для Т-клеточных лигандов, индуцирующих апоптоз при связывании с FasL и TRAIL (Fujikura и соавт., 2013; Kayagaki и соавт., 1999). Как Fas на Т-клетках, так и его лиганд FasL на моноцитах, макрофагах и нейтрофилах, были повышены в группе BALB/c по сравнению с группой Ifnar⁻ᐟ⁻. Экспрессия TRAIL и DR5 была одинаковой в обеих группах мышей. Однако блокирование взаимодействия FasL-Fas или TRAIL-DR5 не снижало количество случаев апоптоза. Более того, авторы не наблюдали различий в экспрессии молекул, ассоциированных с внутренним путем апоптоза. Нейтрализация TNF, напротив, уменьшила количество случаев апоптоза Т-клеток, что указывает на прямую или косвенную роль TNF в этом процессе.

Обсуждение

Описанные здесь результаты показывают, что быстрая скорость репликации вируса SARS-CoV и относительная задержка в передаче сигнала от IFN-I способствовали накоплению воспалительных моноцитов и макрофагов,
повышению проницаемости сосудов и нарушению вирус-специфических Т-клеточных реакций, приводящих к тяжелому заболеванию мышей линии BALB/c, зараженных SARS-CoV. Эти результаты параллельно обнаруживаются у пациентов с SARS. У людей летальные исходы часто сопровождались начальной высокой вирусной нагрузкой (Chu и соавт., 2004) и иммунопатологией с повышенными уровнями IFN-I и цитокинов (Cameron и соавт., 2007). Увеличение количества макрофагов в легких было характерно для пациентов с тяжелой формой SARS (Franks и соавт., 2003; Nicholls и соавт., 2003). Экзогенный IFN-I, введенный до пика вирусного титра, блокирует этот каскад реакций и уменьшает иммунопатологию (рис. 2D и 2E).

Хотя противовирусные и иммуномодулирующие эффекты IFN-I хорошо известны в качестве защиты от вирусных инфекций, становится все более очевидным, что IFN-I также стимулирует неблагоприятные воспалительные реакции при некоторых бактериальных, грибковых и хронических вирусных инфекциях с помощью сложных механизмов, которые, как правило, являются патоген-специфическими (Carrero, 2013; McNab и соавт., 2015; Trinchieri, 2010). Таким образом, IFN-I способствует патологическим эффектам при внутриклеточных бактериальных инфекциях (возбудители M. tuberculosis, L. monocytogenes) путем подавления выработки ключевых молекул-эффекторов (TNF и IL-1) нейтрофилами и моноцитами, приводя к неконтролируемой репликации бактерий (Auerbuch и соавт., 2004; Mayer-Barber и соавт., 2014). При втором механизме IFN-I индуцирует фатальную иммунопатологию при некоторых грибковых инфекциях (Candida albicans) путем активации моноцитов и макрофагов, нейтрофил-опосредованной почечной иммунопатологии (Majer и соавт., 2012).
Кроме того, при персистирующих вирусных инфекциях, вызванных, например, вирусом лимфоцитарного хориоменингита или вирусом иммунодефицита обезьян (SIV), IFN-I способствует постоянной иммунной активации и увеличивает экспрессию ингибирующих молекул, таких как PD-1 и LAG-3, что приводит к нарушению Т-клеточных реакций (Sandler и соавт., 2014; Teijaro и соавт., 2013; Wang и соавт., 2012; Wilson и соавт., 2013). Отсутствие передачи сигнала от IFN-I при инфицировании штаммом PR8 вируса гриппа А (IAV) ведет к накоплению моноцитов с фенотипом Ly6Cint (со средней [intermediate] степенью экспрессии Ly6C), продуцирующих хемокин CXCL1. Последующая миграция нейтрофилов приводит к патологическим процессам в легких (Seo и соавт., 2011). Напротив, заражение IAV некоторых линий мышей привело к летальному исходу, и летальность снижалась при отсутствии передачи сигнала от IFN-I (Davidson и соавт., 2014). В отличие от тяжелых IAV-инфекций, отсутствие сигнала от IFN-I во время высоколетальной инфекции SARS-CoV не стимулировало нейтрофильную инфильтрацию легких, но значительно уменьшало накопление моноцитов и макрофагов (рис. 3 и S3A).

Инфекция вирусом SARS-CoV у мышей линии BALB/c характеризуется быстрой репликацией вируса, с пиком титров между 16 часом и вторым днем после заражения (рис. 2А). В то время как быстрая репликация вируса, вероятно, способствует неблагоприятным исходам, вирус-опосредованная задержка передачи сигнала от IFN-I и относительная резистентность SARS-CoV к IFN-I и его эффекторам, вероятно, играет роль. SARS-CoV абортивно (т. е. без образования новых вирионов) заражает макрофаги и дендритные клетки человека, которые минимально индуцируют IFN-I (Cheung и соавт., 2005; Law и соавт., 2005). Кроме того, SARS-CoV кодирует белки, которые ингибируют индукцию или передачу сигнала от IFN, а также функции эффекторных молекул (Totura и Baric, 2012).

Повышенный ответ IFN-I сопровождался выделением лиганда к рецептору хемокинов CCR2 (рис. 2С и S3B-S3D), что приводило к миграции моноцитов и макрофагов в очаг воспаления у мышей, инфицированных SARS-CoV. Это дополнительно увеличивало выделение IFN-I, лиганда CCL2 и других медиаторов воспаления (рис. 2 и S3C). Несмотря на то, что моноциты и макрофаги являются патогенетическим звеном у мышей линии BALB/c, зараженных SARS-CoV, эти клетки могут играть как защитную роль, так и быть патогенными, что зависит в первую очередь от самого патогена. В других моделях ТОРС у мышей с отсутствием транскрипционного фактора STAT1, зараженных SARS-CoV, макрофаги были патогенными, но и в этом случае патологические изменения в легких вызваны преобразованием фенотипа макрофагов из M1 (классического) в M2 (альтернативно активированного), что приводило к увеличению фиброза и неблагоприятных исходов. У этих мышей блокирование передачи сигнала от STAT-1 в субпопуляциях моноцитов и макрофагов способствовало развитию легочной патологии (Frieman и соавт., 2010; Page и соавт., 2012; Zornetzer и соавт., 2010). При респираторно-синцитиальном вирусе (RSV), вирусе простого герпеса (HSV) и вирусе Западного Нила (WNV) моноциты и макрофаги элиминируют вирусы, являясь защитными клетками (Goritzka и соавт., 2015; Terry и соавт., 2012). Напротив, у мышей, инфицированных штаммом PR8 IAV, данные клетки оказывают двойной эффект: способствуют развитию патологии легких в той же степени, в которой являются необходимыми для оптимальной вирус-специфической Т-клеточной реакции (Aldridge и соавт., 2009; Lin и соавт., 2008).

Несмотря на массивное скопление моноцитов и макрофагов в легких, пораженных SARS-CoV, механизмы, которые вызывают летальный исход остаются не ясными. Наши исследования показывают, что TNF является важным фактором в развитии летального исхода, так как его нейтрализация повышает выживаемость (рис. 4F), но вполне вероятно, что и другие цитокины, вырабатываемые моноцитами и макрофагами, такие как IL-6, IL-1β, NO-синтаза, среди других, оказывают неблагоприятные эффекты.
IFN-индуцированные провоспалительные цитокины запускают экспрессию TRAIL-DR5 и FasL-Fas на миелоидных клетках, а также Т-клетках, которые участвуют в Т-клеточном апоптозе (Boonnak и соавт., 2014; Daigneault и соавт., 2012; Kayagaki и соавт., 1999). Авторы выявили увеличение случаев апоптоза Т-клеток у линии BALB/c в сравнении с мышами Ifnar⁻ᐟ⁻, зараженными SARS-CoV, но в отличие от более ранних исследований (Boonnak и соавт., 2014), они обнаружили, что ни FasL-Fas, ни TRAIL-DR5, ни внутренние пути апоптоза не были вовлечены в этот процесс. Усилению Т-клеточного апоптоза, вероятно, способствовал субоптимальный Т-клеточный ответ (рис. 6). Т-клетки сдерживают цитокиновый шторм (Kim и соавт., 2007), подавляя ответ системы врожденного иммунитета. Поэтому субоптимальные Т-клеточные реакции могут привести к неконтролируемому ответу от клеток врожденного иммунитета с длительным выделением провоспалительных медиаторов и последующей иммунопатологией.

Подводя итог, авторы демонстрируют, что отсроченная экспрессия IFN-I вызывает неадекватную воспалительную реакцию с последующими иммунопатологическими процессами в легких при инфекции, вызываемой SARS-CoV. Более того, минимальные различия в вирусной нагрузке в легких у мышей BALB/c и Ifnar⁻ᐟ⁻ и полная защита от развития заболевания после деплеции моноцитов и макрофагов предполагают, что IFN-I-обусловленные иммунопатологические изменения приводят к увеличению заболеваемости и летальности от SARS-CoV, вне зависимости от степени репликации вируса. Защитный эффект от раннего, но не позднего введения IFN-I (рис. 2D; Haagmans и соавт., 2004; Kumaki и соавт., 2011) и патологические эффекты отсроченного IFN-I-опосредованного ответа позволяют предположить, что IFN-I следует с осторожностью применять при лечении зараженных пациентов. В будущем вместе со снижением начальной вирусной нагрузки с помощью противовирусных препаратов, терапевтические подходы, которые уменьшают иммунопатологические изменения, могут помочь снизить высокие показатели летальности, ассоциированные с возникающими коронавирусными и, возможно, другими высокопатогенными вирусными заболеваниями.

Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl+Enter.