Как SARS-CoV-2 впервые адаптировался к организму человека?

Вирусам необходимы специальные белки для проникновения в клетки, в которых будет происходить их репликация. У коронавируса острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) такой белок получил название шипиковый (spike), или S-белок. S-белок, будучи также мишенью современных вакцин, быстро адаптируется к своим новым хозяевам — людям. Первый большой шаг в этом направлении случился в начале 2020 года, когда произошла замена аминокислоты S-белка 614 (из 1297) с аспарагиновой кислоты (D) на глицин (G). Вирусы, несущие эту мутацию D614G, передаются от человека к человеку быстрее и в настоящее время составляют большую часть вирусной популяции. В данной статье Zhang с соавт. [1] с помощью тщательного структурного анализа показали, как мутация D614G изменила S-белок и как это привело к ускорению пандемии.

На ранних этапах пандемии в отчаянных попытках получить инструменты для изучения SARS-CoV-2 исследователи разработали псевдовирусные системы, позволяющие измерять инфекционность вируса безопасным и поддающимся количественной оценке способом. Такие системы экспрессиют вирусный белок проникновения на поверхности вируса-«репортера» и в течение многих лет использовались для изучения множества подобных белков, включая S-белок «классического» SARS-CoV-1. К сожалению, псевдовирусы на основе S-белка SARS-CoV-2 дают гораздо более слабые сигналы, чем их аналоги на основе подобного S-белка у SARS-CoV-1. Это вызывало недоумение, поскольку биохимическое изучение связывающихся с рецепторами доменов (receptor-binding domains, RBDs) S-белков SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 убедительно продемонстрировало, что RBD SARS-CoV-2 взаимодействует с их общим рецептором, ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АПФ2), с бо́льшим сродством, чем SARS-CoV-1 [2, 3]. Столкнувшись с неэффективными методами, многие вирусологи пришли к тому же решению, что и их коллеги, структурные биологи: изменить сайт S-белка, который расщепляется фуринподобными протеазами в клетках, производящих вирус [2]. Такое изменение сохраняет S1-домен S-белка, содержащий RBD и связывающийся с АПФ2, в ковалентной связи с его S2-доменом, который заякоривает S-белок в составе вириона. Стоит отметить, что некоторые, но не все из этих мутаций по сайту расщепления фурином значительно увеличивали инфицирование клеток псевдовирусом [4].

Данное решение устранило техническую проблему, но усложнило загадку. Несмотря на то, что ряд отдаленно родственных коронавирусов содержат сайт расщепления фурином на границе S1-S2, у S-белка SARS-CoV-1 и всех вирусов линии Sarbecovirus, размножающихся в организме летучих мышей, этот сайт отсутствует. Вместо расщепления в клетках, продуцирующих вирус, их S-белки разрезаются другими протеазами, в то время как вирус взаимодействует с АПФ2 в следующей клетке, чтобы инфицировать ее [5]. Таким образом, мутации в сайте расщепления фурином усовершенствовали функцию S-белка SARS-CoV-2 в псевдовирусах и дали возможность S-белку работать с ферментами поздних стадий проникновения в клетку так же, как у SARS-CoV-1. Почему же тогда мутация у SARS-CoV-2 в сайте расщепления фурина сохраняется, если она сделала инфицирование клеток в культуре менее эффективным? На самом деле, при регулярном пассировании культуры зараженных клеток вирусы теряли этот сайт. Улучшает ли это каким-то образом передачу вируса? Исчезнет ли он со временем в ходе пандемии?

Летом 2020 года Korber с соавт. забили тревогу о «проблемной мутации» — а именно о D614G [6]. В лаборатории данное изменение избавило от необходимости устранять сайт расщепления фурином в S-белке, очевидно, исправляя конструктивный дефект, связанный с этим необычным сайтом [4, 6]. Эксперименты на животных с идентичными в прочих отношениях вирусами показали более высокий уровень репликации варианта D614G в верхних дыхательных путях — области, имеющей важное значение для распространения вируса [7, 8]. Напротив, в нижних отделах дыхательных путей, где размножение вируса ответственно за более тяжелое течение заболевания, значительных различий между двумя вирусами не было [7]. Результаты этих наблюдений согласуются с текущим единым мнением, что присутствующая в настоящее время в большинстве циркулирующих вирусов D614G ускоряет передачу вируса, но, в отличие от более поздних мутаций в S1 [например, Asn501→Tyr (N501Y)], не влияет на частоту госпитализации.

Механизм, обеспечивающий более высокую приспособленность вируса, остается предметом споров. И здесь важным стало второе необычное свойство S-белка, присутствующее и у SARS-CoV-1. S-белок SARS-CoV-2, подобно большинству белков проникновения вирусов с липидными мембранами, образует тримеры. В типичном случае в процессе сборки вириона вирусные белки проникновения незначительно изменяют конформацию, но нарушать тройную симметрию перед связыванием с соответствующим рецептором для них необычно. Так или иначе, зрелый S-белок SARS-CoV-2 часто теряет симметричность, пока один из его RBDs приобретает «открытую» (в положении «вверх») конформацию [1, 9]. Лишь в такой конформации RBDs могут связываться с АПФ2. Как только связывание произошло, домен S1 диссоциирует от S2, а S2 претерпевает значительную перестройку и переходит в состояние после слияния. Высвобожденная при этом энергия используется для слияния мембран вируса и клетки и позволяет вирусу проникнуть внутрь.

Чтобы объяснить роль D614G в повышении приспособленности вируса, некоторые исследователи сосредоточились на влиянии D614G на частоту, с которой обнаруживается открытая конформация, предполагая, что повышение трансмиссивности вирусов, несущих эту мутацию, связана с более эффективным взаимодействием с рецептором [10, 11]. Другие отметили, что у вирусов, экспрессирующих D614G, S-белок распадается реже — возможно, данный эффект усиливается во враждебной среде живого организма. Они обнаружили, что мутация D614G помогала домену S1 удерживать S2, предотвращая преждевременное и непродуктивное приобретение конформации после слияния [4, 9, 12]. Таким образом, вирус имел более функциональные S-белки, которые могли связываться со следующей клеткой и инфицировать ее.

Чтобы разрешить это противоречие, Zhang с соавт. исследовали структуру и провели детальный анализ обоих S-белков — как D614, так и G614 — в различных состояниях. Первым делом они отметили, что, в соответствии с предыдущими наблюдениями, потеря D614 в S1 разрывает ионную связь с проксимальным лизином, K854, в S2 [9]. Потеря этого солевого мостика кажется контринтуитивной, поскольку она будет ослаблять ассоциацию S1 с S2, хотя и может облегчать перемещение RBD в конфигурацию «вверх». Так или иначе, структуры, полученные Zhang с соавт. показывают, что главное различие между S-белками с D614G — заметно большая упорядоченность региона с 620 по 640 аминокислотные остатки, который авторы назвали «петля 630». Эта петля располагается сразу же за G614. Таким образом, становится возможным, что как потеря солевого мостика D614-K854, так и повышенная гибкость остова, обеспечиваемая глицином, помогает петле 630 прочнее закрепиться в углублении, сформированным двумя более крупными доменами S-белка (N-концевым доменом и С-концевым доменом 1). Тем не менее, петля оказывается в более жестком и стабильном положении между этими доменами, если в позиции 614 стоит G, а не D.

Разгадка в том, что придание обоим RBD открытой конформации и диссоциация S1 от S2, которая обеспечивается расщеплением с помощью фурина, требуют нарушения организации петли 630. Так, открытая конформация RBD легче достигается в случае исходного D614 S-белка, но как только она наступает, такой S-белок более склонен распадаться полностью из-за преждевременного отделения домена S1. С G614, напротив, больше энергии необходимо для достижения состояния, в котором один RBD находится в положении «вверх», но диссоциация S1 от S2 также становится менее благоприятна, поскольку оставшиеся петли 630 продолжают удерживать тример вместе. Получается, что у вирусов с мутацией D614G S-белков в положении «вверх» больше, так как следующий, необратимый шаг в сторону инактивации замедляется. Инфицирование вариантом D614G более эффективно, поскольку предотвращает преждевременное отделение S1 (рис. 1).
 

Описанные структурные исследования имеют практическое применение. Все существующие вакцины основаны на оригинальной, нестабильной форме D614 S-белка [13]. К счастью, большинство разработчиков вакцин, включая Moderna и Pfizer-BioNTech, учли исследования SARS-CoV-1 и коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS), в которых внедрение новых пролиновых остатков в S2 замедляло отделение S-белка [14]. Разработчики вакцин Johnson and Johnson и Novavax предусмотрительно также удалили сайт расщепления фурином. Основой вакцины, разработанной Оксфордским университетом и компанией AstraZeneca, напротив, является S-белок дикого типа (содержащий D614); то же можно сказать и о вакцине на основе инактивированного вируса от Sinovac. Для ясности стоит сказать, что другие переменные — особенно системы доставки антигенов — с большой вероятностью ответственны за различия в эффективности разных вакцин. Так или иначе, сравнительные исследования на животных показывают, что на эффективность вакцин влияют и присоединение пролиновых остатков, и удаление сайта расщепления фурином [15]. Весьма вероятно, что следующее поколение вакцин, лучше соответствующих циркулирующим вариантам S-белка, будут включать D614G. Вакцины с немодифицированным S-белком с G614 могут показать относительный скачок действенности, так как данная замена компенсирует недостаток встроенных стабилизирующих мутаций.

Работа Zhang с соавт. также помогает лучше понять естественную историю вируса. Заметное появление D614G позволяет предположить, что приобретение дестабилизирующего сайта расщепления фурином — недавнее событие. Вирус легко мог потерять этот сайт, что часто происходит в культурах клеток и определенным образом приводит к усилению передачи вируса от человека к человеку. Это не тот вывод, которого ожидает большинство исследователей человеческих коронавирусов — при том, что данного сайта нет у SARS-CoV-1, который передается с достаточной эффективностью, а у менее родственного коронавируса MERS, который передается менее активно, сайт есть. Каким образом сайт расщепления фурина у SARS-CoV-2 способствует возникновению новых инфекций у людей остается главным открытым вопросом в данной области.