Лабораторная диагностика ВИЧ. Современные реалии
Вирус иммунодефицита человека — грозное хроническое инфекционное заболевание, которое захлестнуло человечество во второй половине XX века. Бессимптомное течение, невозможность окончательного излечения и сокращение продолжительности жизни при отсутствии антиретровирусной терапии: ВИЧ ужасал и обезоруживал в своем дебюте.
Но прогресс не стоит на месте. За более чем сорокалетнюю историю заболевания медицина достигла значительных успехов в изучении ВИЧ, в частности — в алгоритмах и методах диагностики вируса.
В сегодняшней статье мы расскажем, как обстоят дела с лабораторной диагностикой ВИЧ, и разберемся в современных тенденциях выявления данного заболевания.
Этот текст мы подготовили совместно с Imbian — компанией, которая разрабатывает и производит медицинские тест-системы для диагностики заболеваний человека.
С чего все началось
После выделения и описания вируса, связанного со СПИДом, в 1983 году были разработаны диагностические тесты с использованием отдельных изолятов HTLV III (Abbot и Electronucleonics) и вируса лимфаденопатии (LAV) (генетические системы). В этих иммуноферментных анализах (ИФА) и методах хемилюминесценции в качестве антигенных мишеней использовались белки, выделенные из инфицированных вирусом культур тканей. Анализы выявляли только антитела IgG к ВИЧ-1.
Тесты первого поколения обладали высокой чувствительностью, но имели диагностическое окно до 12 недель или более после заражения и обладали низкой специфичностью. Последнее приводило к частым ложноположительным результатам, которые были связаны с инфекциями, аутоиммунными заболеваниями, беременностью и неуточненными состояниями. Поэтому (аналогично тестированию на сифилис) был добавлен второй уровень тестирования для улучшения специфичности. Две процедуры были одобрены FDA в качестве подтверждающих тестов только на антитела к ВИЧ-1: иммунофлюоресцентный анализ HTLV III (метод флуоресцирующих антител, МФА) и вестерн-блоттинг или иммуноблоттинг. Как и скрининговые анализы, каждый из них обнаруживал только IgG против ВИЧ и имел отрицательные на антитела окна шесть недель или более.
Был разработан алгоритм тестирования, при котором наблюдалась реакция в двух образцах крови. Если один или оба образца были реактивными, выполнялась процедура подтверждения. Только образцы, которые неоднократно реагировали в скрининговом тесте и проявлялись в подтверждающем тесте, имели окончательную интерпретацию как положительную. Но даже при такой комбинации с тестами первого поколения невозможно было избавиться от диагностических ошибок. Этот момент породил потребность в более совершенных тестах, которые можно было бы использовать для диагностики ВИЧ-инфекции.
Тесты на ВИЧ второго поколения, разработанные в конце 1980-х годов, улучшили специфичность и, следовательно, положительную прогностическую ценность процедур скрининга за счет добавления рекомбинантных антигенов, в частности, ВИЧ-1 p24, в антигенную среду. Часто производители добавляют в антигенный препарат белок ВИЧ-2 и белок ВИЧ-1 группы О, чтобы обнаружить антитела к этим вирусам.
Тесты второго поколения сократили отрицательное на антитела окно до 4–6 недель после заражения. Поскольку эти анализы могли обнаруживать антитела к ВИЧ-2 в дополнение к антителам к ВИЧ-1, в алгоритм было добавлено подтверждающее тестирование и на ВИЧ-2.
Добавление обнаружения IgM к процедуре анализа привело к тесту на ВИЧ третьего поколения. Хотя специфическое обнаружение IgM не было клинически полезным, комбинация IgG/IgM сократила отрицательное окно антител примерно до трех недель после заражения. Также может быть выполнен ИФА для обнаружения антигена p24, который обнаруживает вирус уже через две недели после заражения. Однако общий алгоритм тестирования остался прежним, и результаты повторного реактивного скрининга по-прежнему подтверждались иммуноблоттингом или МФА.
В конце 1990-х годов производители разработали анализы на ВИЧ, которые сочетали в себе обнаружение антител и антигенов. Как и прежде, это были процедуры на основе ИФА и хемилюминесценции. Эти тесты сократили окно отрицательного результата теста примерно до двух недель. Хотя в этих процедурах обнаруживались как антитела, так и антигены, тест давал только один результат и не дифференцировал, был ли положительный результат связан с присутствием антигена ВИЧ-1 p24 или с наличием антител к ВИЧ-1 или ВИЧ-2. Хотя эти тесты использовались за пределами Соединенных Штатов в течение многих лет, первой процедурой четвертого поколения, одобренной FDA, был метод Abbot Architect, который был одобрен в августе 2010 года.
Когда в Соединенных Штатах были приняты тесты на ВИЧ четвертого поколения, понадобился новый алгоритм тестирования. Последующее тестирование требовало обнаружения как антигена, так и антител. Иммуноблоттинг, который имеет 4–6-недельное окно с отрицательным результатом на антитела, может давать ложноотрицательные результаты у пациентов с ранней инфекцией, которые могут быть идентифицированы с помощью анализа четвертого поколения. Таким образом, иммуноблоттинг был заменен анализом дифференцировки антител к ВИЧ.
Первоначально Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) предложил два отдельных алгоритма тестирования четвертого поколения: один для районов с низким риском заражения ВИЧ и другой — для районов высокого риска, однако в 2014 году был доработан единый алгоритм. Новый алгоритм следовал тесту четвертого поколения с процедурой дифференцировки ВИЧ-1/2, чтобы определить, есть ли у пациента антитела к ВИЧ-1 или ВИЧ-2. Образцы, которые неоднократно реагировали с помощью анализа четвертого поколения и все же были отрицательными по процедуре дифференцировки ВИЧ-1/2, должны были быть протестированы с использованием качественного анализа ПЦР РНК ВИЧ-1, чтобы определить, присутствует ли ВИЧ-1.
В 2015 году FDA одобрило метод мультиплексного анализа скринингового теста на ВИЧ пятого поколения в качестве диагностического анализа. Этот тест, как и процедуры четвертого поколения, обнаруживает как антитела к ВИЧ, так и антиген ВИЧ-1 p24, но дает отдельные результаты для каждого аналита. Однако на данный момент нет четкого алгоритма с использованием тестов пятого поколения, поэтому все пока остаются на тестах предыдущего поколения.
Методы и алгоритмы диагностики ВИЧ
Существует несколько способов диагностики ВИЧ-инфекции. Выбор наиболее подходящего метода зависит от понимания естественного течения ВИЧ-инфекции, т. е. от того, какой маркер присутствует в данный момент после заражения (рис. 1).
ВИЧ реплицируется при попадании в организм и экспрессирует антиген на поверхности инфицированных клеток. Нарастает иммунный ответ, при этом активированные клетки CD4 и макрофаги мигрируют к очагу инфекции. По иронии судьбы, эти активированные клетки являются основными мишенями ВИЧ, и после заражения они вызывают более сильный иммунный ответ, способствуя дальнейшему распространению инфекции. Этот процесс занимает от трех до четырех дней после воздействия (в течение периода «затмения» (eclipse period), который определяется как время между воздействием и возможностью обнаружения РНК ВИЧ в плазме). Как только достигается критическая масса клеток иммунной системы, репликация вируса увеличивается в геометрической прогрессии, производя от 10 до 100 миллиардов вирионов в день. Эти вирусные частицы могут быть обнаружены уже на пятый день после установления инфекции и достигают своего пика на 20-й день, когда начинает действовать более эффективный иммунный ответ, контролирующий инфекцию. Вирусный антиген (белок p24) можно обнаружить примерно на 14-й день. В зависимости от силы иммунного ответа симптомы острого сероконверсионного синдрома могут развиться у пациента примерно на 7–12-й день. Признаки иммунного ответа можно обнаружить на 20-й день: это положительная реакция на антитела IgM. Вскоре после этого обнаруживаются антитела IgG в сыворотке.
Итак, что это значит при выборе метода диагностики:
- В период «затмения» до установления виремии на пятые сутки инфицирование не выявляется.
- К 6–8 дню вирус можно обнаружить с помощью теста амплификации нуклеиновых кислот (ТАНК или NAAT – nucleic acid amplification test).
- Вирусные белки (антиген p24) можно обнаружить между 13 и 20 днями.
- Антитела, изначально в форме IgM, обнаруживаются к 20-му дню, а IgG обнаруживаются к 30-му дню.
Из-за высокой стоимости NAAT уступает первенство комбинированным тестам антиген-антитело, в которых используется антиген p24 для выявления инфекции на ранних стадиях, в настоящее время это стандартные тесты в больницах и коммерческих лабораториях. Большинство этих тестов могут выявить инфицирование ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
NB! Да, существует два вида ВИЧ: более распространенный ВИЧ-1 и редкий ВИЧ-2. Предполагается, что эти вирусы возникли в результате независимой передачи людям SIV (вируса иммунодефицита обезьян) от шимпанзе и мангобеев, соответственно.
Для первичной и подтверждающей (верификационной) диагностики ВИЧ CDC разработал определенный алгоритм действий. Первоначальное тестирование на ВИЧ следует проводить с помощью иммуноанализа антиген-антитело, который выявляет антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, а также антиген р24 ВИЧ-1. Если тест не реагирует на первоначальный иммуноанализ, он считается отрицательным, и дальнейшее тестирование не показано, если только нет клинического подозрения на очень раннюю инфекцию (до того, как может быть обнаружен антиген р24); в этом случае проводится NAAT ВИЧ-1 для выявления РНК ВИЧ. Образцы с результатами иммуноанализа на реактивный антиген и антитела должны быть протестированы с помощью дополнительного иммуноанализа на антитела, который отличает антитела к ВИЧ-1 от антител к ВИЧ-2; реактивный результат этого теста интерпретируется как положительный на антитела к ВИЧ-1 или антитела к ВИЧ-2, соответственно. Образцы, которые реагируют на исходный анализ на антиген и антитела, но нереактивные (или неопределенные) при анализе на ВИЧ-1-специфичные и ВИЧ-2-специфичные антитела, следует протестировать с помощью NAAT на ВИЧ-1. Положительный NAAT в данном случае является диагностическим признаком острой инфекции ВИЧ-1. Отрицательный результат NAAT на ВИЧ-1 и нереактивный или неопределенный результат иммуноферментного анализа на дифференцировку антител к ВИЧ-1 указывают на ложноположительный результат на ВИЧ-1.
Помимо классических "лабораторных" методов тестирования, существует экспресс-тестирование. В экспресс-тестах в качестве образцов может использоваться либо цельная кровь (< 10–50 мкл), взятая из пальца, либо мазок из полости рта (слюна или десневое отделяемое). Эти тесты удобны и просты в применении, поэтому отлично подходят и для самообследования.
Лабораторное тестирование на ВИЧ более точное, но экспресс-тесты имеют высокий уровень чувствительности и специфичности и могут выручить, например, когда поход в больницу или лабораторию невозможен или затруднен.
Диагностика ВИЧ в России
NB! Тестирование на ВИЧ доступно в большинстве городов России. Тест сдается только по желанию пациента, его можно сдать анонимно. Проведение теста без согласия тестируемого является незаконным.
В отечественных реалиях также используются системы тестирования четвертого поколения для выявления ВИЧ, в том числе и экспресс-тестирование, однако в системе подтверждения ВИЧ-серопозитивности используются методы ПЦР и иммуноблоттинга.
Диагностику ВИЧ в России условно можно разделить на три этапа:
- Скрининговый: предназначен для выполнения первичных исследований крови на ВИЧ-инфекцию.
- Референтный: позволяет с помощью специальных методических приемов уточнить первичный результат, полученный на скрининговом этапе.
- Экспертный: предназначен для окончательного подтверждения или исключения наличия специфических маркеров ВИЧ-инфекции, выявленных на предыдущих этапах лабораторной диагностики.
Для проведения скрининга используются комбинированные тест-системы для одновременного выявления антител к ВИЧ-1,2 и антигена р24 ВИЧ-1.
В России одним из разработчиков и производителей таких систем экспресс-тестирования является компания Imbian. Они производят тест-системы четвертого поколения для выявления ВИЧ на ранних сроках заражения с возможностью определить антиген р24 (белок вируса) и антитела к вирусу ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Важно, что система подходит и для самостоятельного тестирования.
При получении отрицательного результата на фоне имеющихся у пациента серьезных эпидемиологических предпосылок и характерных для декомпенсированного иммунодефицита клинических проявлений (СПИД) рекомендуется повторное ИФА-исследование с использованием тест-систем четвертого поколения или ПЦР.
Первичный положительный результат проверяется выполнением повторного исследования образца в той же тест-системе. При получении отрицательного второго результата исследование проводится третий раз, по возможности в тест-системе другой серии. Все результаты заносятся в журнал повторных исследований. В случае получения первого положительного и двух последующих отрицательных результатов выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ-1, 2 и антигена р24 ВИЧ-1.
Если же результаты ИФА или ПЦР являются положительными, пациент направляется на экспертный этап обследования, где проводится иммуноблоттинг. Данный метод является окончательным способом подтверждения/исключения ВИЧ и проводится в референс-лаборатории. Для этого исследуемый образец сыворотки аликвотируется, составляется сопроводительное письмо, после чего все это отправляется в референс-лабораторию из скрининговой лаборатории.
Сочетание ВИЧ и вирусного гепатита С
У пациентов с ВИЧ стремительно развиваются гепатиты, сифилис, туберкулез и многие другие заболевания. Это напрямую связано с повреждением иммунной системы и неспособностью организма противостоять инфекционным агентам.
Отдельного внимания во всем многообразии возможных коинфекций заслуживают пациенты с сочетанием ВИЧ и вирусного гепатита С (ВГС). По данным Всемирной организации здравоохранения от 2 до 15% инфицированных ВИЧ также страдают от ВГС, а CDC заявляет о 21% людей с коинфекцией в Соединенных Штатах.
В общем, сочетание ВИЧ и ВГС является частой проблемой. И серьезной, ввиду длительного бессимптомного течения вирусного гепатита С.
Несмотря на всю сложность ситуации и возможных последствий для пациента, с точки зрения диагностики все относительно просто. При уже верифицированном ВИЧ производится исследование на вирусный гепатит С при помощи экспресс-тестирования, а также методами ИФА и ПЦР в России, с использованием ИФА и ПЦР/NAAT — в странах Европы.
Компания Imbian выпускает тест-системы для выявления вирусных гепатитов, в т. ч. и ВГС. Результат известен через 10–15 минут — это удобно в ситуации, когда нет лаборатории под рукой.
Вместо заключения
Время и прогресс в области медицины позволяют создавать более совершенные методы диагностики ВИЧ. Уже сейчас разрабатываются алгоритмы для использования тест-систем пятого поколения, которые будут еще точнее и быстрее выявлять ВИЧ.
Все же, что остается врачам на данный момент: соблюдать алгоритмы диагностики и заниматься просвещением населения о важности обследования на предмет ВИЧ.
Список литературы
- Alexander T. S. Human immunodeficiency virus diagnostic testing: 30 years of evolution //Clinical and Vaccine Immunology. – 2016.
- Deeks S. G. et al. HIV infection //Nature reviews Disease primers. – 2015.
- Saag M. S. HIV infection—screening, diagnosis, and treatment //New England Journal of Medicine. – 2021.
- HIV and Hepatitis C | NIH
- Pooled NAAT following Various HIV Antibody Tests
- Жданов К. В. ВИЧ-инфекция. Диагностика, лечение и профилактика в Вооруженных Силах Российской Федерации (методические указания) //СПб: ВМедА. – 2019.
