Ионные каналы обеспечивают условия для электрической связи в бактериальных сообществах.

Arthur Prindle, Jintao Liu, Munehiro Asally, San Ly , Jordi Garcia-Ojalvo & Gu¨rol M. Su¨el Исследование бактериальных ионных каналов приводит фундаментальные сведения о структурной основе нейрональной передачи; однако, природная роль ионных каналов бактерий по прежнему остается сложной для понимания. Здесь мы продемонстрируем, что ионные каналы внутри сообществ бактериальных биопленок проводят электрические сигналы большой дальности, посредством пространственно распределяющихся волн калия. Эти волны происходят в результате положительной обратной связи, в которой метаболический триггер стимулирует высвобождение внутриклеточного калия, который, в свою очередь, деполяризует соседние клетки. Распространяясь через биопленку, эта волна деполяризации координирует метаболические состояния среди клеток внутри и на периферии биопленки. При ликвидации калиевого канала эта ответная реакция прекращает свое существование. Как и прогнозировала математическая модель, мы так же покажем, что пространственное распределение может быть затруднено специфическими генетическими искажениями открытия мембранного калиевого канала. Вместе, эти результаты демонстрируют функцию ионных каналов в бактериальных биопленках, а так же предоставляют прокариотическую парадигму для активной электрической передачи, имеющей большой радиус действия в клеточных сообществах. Связь посредством электрического сигнала распространена среди биологических систем, одним из самых известных примеров является потенциал действия в нейронах, опосредованный ионными каналами. На протяжении многих лет, исследования бактериальных ионных каналов приводили фундаментальные аналитические результаты в отношении структурной основы, такой же, как при нейрональной передаче. В частности, прокариотический калиевый ионный канал KcsA первым предоставляет  структурную информацию об ионной селективности и проводимости. Совсем недавно было показано, что бактерия обладает множеством важных классов других ионных каналов, таких, как натриевые каналы, хлорные каналы, кальций-зависимые калиевые каналы и ионотропные глутаматные рецепторы, аналогичные тем, что находятся в нейронах. Тем не менее, природная роль этих ионных каналов в бактерии в значительной степени остается неясной. Активны попытки раскрыть функцию ионного канала бактерии играющего определяющие роли в реакции экстремальной кислотной резистентности и в осморегуляции, ион-специфические каналы до сих пор не предстали полностью ответственными за эти клеточные процессы. Остается невыясненным, могут ли ионные каналы поддерживать другие уникальные функции у прокариот. Мы предположили, что обучающаяся бактерия, в своей родной обстановке сообщества биопленки, может открыть новую информацию о функции ионных каналов бактерии. Бактериальные биопленки - организованные сообщества, содержащие миллиарды плотно упакованных клеток. Такие сообщества, макроскопически могут проявлять завораживающую пространственную координацию. Тем не менее,остается неясным, как микроскопические бактерии могут эффективно сообщаться на больших расстояниях. Чтобы исследовать этот вопрос, мы изучили микробное сообщество Bacillus subtilis, которое, как ранее было сообщено, подверглось метаболическим колебаниям инициированным ограничением питательных веществ. Динамика колебаний возникла в результате долгосрочной метаболической созависимости между клетками внутри и на периферии биопленки (рис. 1а).  В частности, внутренние и периферические клетки конкурировали за глутамат, при этом деля аммоний. В результате, рост биопленки периодически останавливался, увеличивая доступность нутриентов для укрытых внутри клеток. Интересно, что глутамат (Glu2) и аммоний  (NH4+) - полные метаболиты, чье относительное поглощение и хранение зависит, как известно, от трансмембранного электрического потенциала и протонной движущей силы. Таким образом, мы заинтересовались, может ли координация метаболизма среди отдаленных клеток в биопленке включать в себя так же форму электрохимической передачи. Колебания мембранного потенциала. Для мониторинга продолжительных электрических колебаний в бактериальном сообществе в зависимости от пространства и времени, мы вырастили биопленки в нестандартно большом микрокапиллярном  устройстве (рис. 1б). Для измерения электрической передачи мы использовали флуоресцентный катионный краситель тиофлавин Т (ThT) для количественной оценки мембранного потенциала внутри биопленки. ThT заряжен положительно и может сохраняться в клетках из-за отрицательного электрического мембранного потенциала внутри клеток. Таким образом, клетки с отрицательным мембранным потенциалом будут задерживать больше ThT, позволяя ему действовать, как индикатор напряжения Нернста. Мы подтвердили, что ThT верно сообщает мембранный потенциал, сравнив его с авторитетным указателем мембранного потенциала бактерий - йодидом дипропилтиадикарбоцианина (DiSC3(5)). Мы обнаружили, что ThT, в сравнении с DiSC3(5), имеет приблизительно в три раза более высокую чувствительность к изменениям мембранного потенциала. Кроме того, мы подвергли клетки незначительным изменениям во внешнем pH, который, как известно, изменяет мембранный потенциал, и наблюдали ожидаемые изменения в ThT. Таким образом, ThT точно сообщает об изменениях мембранного потенциала бактерий обитающих в биопленках. Следом мы исследовали изменения в мембранном потенциале во время метаболических колебаний. В частности, количественные измерения флуоресцентного ThT показали всеобщие и самостоятельные колебания согласующиеся с отчетным периодом метаболических колебаний (рис. 1с). Кроме того, колебания в ThT могут подавляться путем обогащения среды глутамином, который обходит необходимость в глутамате и аммонии. Эти данные показывают связь между метаболическими колебаниями и мембранным потенциалом. Примечательно, что колебания в мембранном потенциале были синхронизированы между даже самыми отдаленными областями сообщества биопленки (рис 1д, е). Мы заинтересовались, может ли активная электрохимическая передача быть ответственной за широкий диапазон синхронизации. Источник: журнал Nature Биопленки производят синхронные колебания в мембранном потенциале. А, биопленки генерируют коллективные метаболические колебания, приводящие к метаболическим взаимодействиям дальнего радиуса между внутренними и периферическими клетками. Остается неясным, как микроскопические бактерии связываются через такие макроскопические расстояния в пределах сообществ биопленок. В, схема микрокапиллярного устройства, используемого в данном исследовании (слева). Изображение контраста фаз биопленок растущих в микрокапиллярном устройстве с клеточной ловушкой выделены желтым (справа). Измерительная шкала, 100 мм. С, всеобщие колебания в мембранном потенциале биопленок сообщества, сообщаемые тиофлавином (ThT). ThT заряжен положительно, но активность транспорта не известна, так что он может быть сохранен в клетках по причине отрицательного мембранного потенциала внутри клетки. Флуорисценция ThT увеличивается, когда заряд внутри клетки становится более отрицательным, и, таким образом, ThT обратно пропорционален мембранному потенциалу. Измерительная шкала, 0,15мм. Представленные изображения демонстрируют отбор из более чем 75 независимых биопленок. П. Е. – произвольные единицы. D, колебания мембранного потенциала высоко синхронизированы даже между самыми отдаленными областями биопленки. Для анализа синхронизации, края биопленки были идентифицированы и выровнены (слева), а затем очерчены в течение долгого времени (справа). Е, временной промежуток тепловой карты показан в д. Выделенное жирно – среднее 30 интервалов. Активная передача калиевого сигнала. Изменения мембранного потенциала включают движение заряженных частиц через клеточную мембрану. Мы заподозрили участие калия, поскольку он является наиболее распространенным катионом во всех живых клетках и может быть сопричастным, играя роль в формировании биопленки. B. subtilis использует активные механизмы транспорта калия, концентрируя внутриклеточный калий приблизительно до 300 mM. Данная внутриклеточная концентрация приблизительно в 40 раз выше концентрации во внешней среде. Следовательно, стремительное высвобождение этого калиевого градиента приведет к увеличению внеклеточной концентрации калия и генерации изменения мембранного потенциала. Соответственно, мы использовали флуоресцентный химический калиевый краситель, asante potassium green-4 (APG-4), для измерения внеклеточной концентрации калия в биопленке (рис. 2а). Мы наблюдали всеобщие колебания в APG-4 что коррелирует с мембранным потенциалом, который наводит на мысль о том, что колебания мембранного потенциала могут повлечь за собой высвобождение калия (рис. 2б). В соответствии с этим выводом, колебания во внеклеточном калии выходят за пределы биопленки к окружающей среде роста. Мы также измерили динамику натрия, другого иона обычно используемого клетками для модуляции мембранного потенциала, и не наблюдали никаких колебаний. Вместе эти исследования свидетельствуют о том, что калий играет роль в синхронизации колебаний мембранного потенциала. Кроме того, мы полностью проверили, что колебания в мембранном потенциале были вызваны потоком калия через клеточную мембрану. В частности, мы зафиксировали чистый поток калия через клеточную мембрану, путем добавления питательной среды с 300 мМ KCl (соответствует внутриклеточной концентрации калия) (рис 2д). Когда мы применили эту химическую фиксацию калия, колебания в мембранном потенциале резко прекратились (рис. 2е). Применение этой фиксации вместе с валиномицином, переносчиком ионов калия, который действует как калий-специфичный курьер в клеточной мембране, привело к аналогичному подавлению колебаний. Таким образом, изменения в электрохимическом потенциале для калия произвели впечатление необходимых для наблюдаемых колебаний в мембранном потенциале. Далее, мы определили которые клетки могут активно распространять внеклеточный калиевый сигнал через биопленку поддерживая связь на большом расстоянии. Вместе с тем, диффузные сигналы распада в пространстве и времени, активируя сигнальные процессы могут усиливать сигнал, избегая такого распада (рис. 2f).Чтобы определить, какие из этих процессов могут работать в биопленке, мы наблюдали за распространением внеклеточной калиевой передачи (рис. 2g). Результаты показывают, что сигнал проходит с постоянной скоростью распространения. Кроме того, амплитуда сигнала не затухает с пройденным расстоянием, в отличие от той, что предполагается для пассивной диффузии калия (рис. 2h). Эти результаты согласуются с процессом, в котором клетки распространяют калиевый сигнал. Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что биопленка синхронизирует всеобщие колебания мембранного потенциала путем активного процесса передачи с участием ионов калия. Передача, опосредованная калиевыми ионными каналами. Руководствуясь нашими находками, мы изучили роль ионных каналов в наблюдаемой калиевой передаче.Мы сфокусировались на YugO, единственном экспериментально охарактеризованном калиевом канале в B. subtilis, который так же описан важным для формирования биопленки. Ток калия через YugO, открытие которого регулируется внутриклеточным доменом TrkA, как известно регулируется метаболическим состоянием клетки. Соответственно, мы предположили, что метаболическое ограничение может формировать инициирующий триггер для активации YugO. В частности, поскольку ограничение глутамата, как известно лежит в основе метаболических колебаний, мы ожидали, что переходный уровень глутамата может инициировать высвобождение калия. Чтобы проверить это, мы временно лишили клетки глутамата и измерили внеклеточный калий в обоих “стертых” штаммах: дикого типа и yugO. Как и ожидалось, мы наблюдали увеличение внеклеточного калия для “стертого” штамма дикого типа, но не для yugO (рис. 3а). Эти находки показывают, что ограничение глутамата может пустить калиевую передачу через калиевый канал YugO. Далее мы исследовали, может ли YugO так же играть роль в активном распространении калиевого сигнала. Чтобы проверить это, мы измерили реакцию “стертых” штаммов дикого типа и YugO на пограничные всплески внешнего калия (300 мМ KCl). Как и ожидалось, воздействие калия во-первых привело к кратковременной деполяризации мембранного потенциала в обоих штаммах. Тем не менее, в штамме дикого типа эта начальная деполяризация обычно следовала за фазой длительной гиперполяризации, чего не наблюдалось у выделенного штамма yugO (рис. 3b). Этот период гиперполяризации сопровождался увеличением внеклеточного калия. Вместе эти данные указывают, что экспозиция калия - основная причина высвобождения внутриклеточного калия через YugO. Воздействие эквивалентной концентрации сорбитола (нейтрального раствора) не вызывает эквивалентного ответа, исключая чисто осмотические эффекты. Таким образом, YugO видимо играет роль в распространении внеклеточного калиевого сигнала внутри биопленки. Источник: журнал Nature А, внеклеточный флуоресцентный химический краситель  (APG-4) сообщает концентрацию калия в середине (развернутые данные, 2а,б). Для сравнения, те же клетки показаны окрашенными с ThT, который обратно связан с мембранным потенциалом. Эти изображения показывают клетки на пике колебаний ThT. Представленные изображения выбраны из шести независимых экспериментов. Измерительная шкала, 2мм. В, всеобщие колебания внеклеточного калия на всем протяжении биопленки. Белая линия показывает край биопленки. Представленные изображения выбраны из шести независимых экспериментов. Измерительная шкала 0,2 мм. С, колебания в мембранном потенциале и внеклеточном калии синхронизированы, предполагается, что выпуск калия участвует во всеобщих колебаниях мембранного потенциала. ThT обратно связан с мембранным потенциалом. Представленные следы взяты из эксперимента, показанного в б. Химическая фиксация калия (300 мМ KCl, соответствует внутриклеточной концентрации) предотвращает образование калиевых электрохимических градиентов через клеточную мембрану. Е, фиксация чистого потока калия гасит колебания мембранного потенциала. Представленные следы выбраны из двух независимых экспериментов. F, иллюстрация различий между пассивной передачей (диффузией) и активной передачей.  Когда клетки пассивно реагируют на сигнал, уровень сигнала может быть ограничен из-за снижения должной амплитуды сигнала. В противоположность этому, когда клетки активно реагируют на усиление сигнала, распространение может простираться на большие расстояния. G, мы измерили распространение внеклеточного калия путем измерения APG-4 во времени и по длине примерно в пределах 1,5 мм на протяжении биопленки. H, амплитуда внеклеточного калия относительная постоянная распространению сигнала, в отличие от предсказанного распада амплитуды пассивного сигнала. Представленные данные выбраны из шести независимых экспериментов. Линия диффузии рассчитывалась с помощью уравнения диффузии 2D и коэффициента диффузии для калия в пределах биопленки (дополнительная информация). Математическое моделирование электрической передачи. Наши данные, таким образом указывают на предполагаемый механизм, где метаболическое напряжение клеток высвобождает внутриклеточный калий и приводит к росту внеклеточного калия вводя соседствующие клетки в дополнительный метаболический стресс (рис. 3с). В B. subtilis, глутамат транспортируется совместно с двумя протонами через GltP транспортер и этот процесс зависит от протон движущей силы. Калий-опосредованная деполяризация мембранного потенциала может временно снижать электрический компонент протон движущей силы и, тем самым, снижать  поглощение глутамата и удержание внутриклеточного аммония. Таким образом, калий-опосредованная передача может распространять метаболический стресс на дальние клетки. (рис. 3с, справа). Соответственно, гиперполяризация вызванная путем активации YugO может представлять клеточный ответ усиливающий поглощение глутамата или удержание аммония. Это понятие поддерживается нашей находкой, что ответ на внеклеточный калий может быть отменен ростом клеток в глутамине, незаряженным метаболитом и предпочтительным источником азота, который обходит необходимость в глутамате и аммонии. Этот результат так же поддерживает конкретную связь между калий опосредованной электрической передачей и метаболическим стрессом. Чтобы определить, является ли предложенный механизм основанный на калиевом канале достаточным для объяснения наблюдаемых распространяющихся импульсов электрической активности, мы обратились к математическому моделированию. В частности, мы рассмотрели минимальную, основанную на проводимости модель, описывающую динамику мембранного клеточного потенциала в терминах одиночного калиевого канала и тока утечки. В соответствии с нашими экспериментальными результатами, эта простая модель имеет переходную деполяризацию следующую за гиперполяризацией в ответ на локальные увеличения концентрации калия  во внеклеточном пространстве (рис. 3d). Кроме того, модель показывает распространение на большие расстояния этих возбуждений, без затухания амплитуды колебаний мембранного потенциала (рис. 3е). Таким образом, предлагаемый механизм достаточно качественно объясняет наблюдаемые динамики мембранного потенциала и активного распространения в пространстве. Модель также предсказывает, что снижение эффективности функции калиевого канала может привести к ухудшению связи на дальние расстояния (рис. 3е). С полным удалением препятствий yugO развитию крупных биопленок, мы создали штамм в котором мы удалили домен открытия мембранного канала TrkA, оставив нетронутой только часть ионного канала YugO. Аналогично усеченные калиевые каналы, как показано, видоизменили открытие мембранных каналов и ионную проводимость. Действительно, мутантные биопленки yugODtrkA показали снижение распространения колебаний мембранного потенциала (рис. 3f). В частности, в отличие от дикого типа, мутант yugODtrkA показывает затухание амплитуды сигнала от клеток внутренней части биопленки к переферии, что так же согласуется с прогнозами модели (рис. 3g). Таким образом, открытие мембранных каналов YugO, кажется, способствует эффективной электрической связи между дальними клетками. Источник: журнал Nature А, yugO – это калиевый канал в B. Subtilis, который открывается внутриклеточным доменом trkA, который регулируется метаболическим состоянием клетки. Извлечение глутамата (единственного источника азота в среде MSgg) индуцирует увеличение внеклеточного калия (APG-4) для дикого типа, но не для штамма с удаленным yugO. Столбцы ошибки показывают среднее 6 s. d. для каждой из трех независимых биопленок. В, внешний калиевый шок (300 мМ, KCl)индуцирует краткосрочную деполяризацию мембранного потенциала в диком типе и yugO удаленном штаммах. Тем не менее, в диком типе начальная деполяризация следовала за гиперполяризацией, которая не наблюдалась в yugO удаленном штамме (имея в виду 6 s. d. Для 12 следов взятых из трех биопленок). ThT обратно связан с мембранным потенциалом. С, предлагаемая модель для передачи калия. Начальный триггер для высвобождения калия – это метаболический стресс, вызванный ограничением глутамата. Внешний калий деполяризует соседние клетки, приводя к дальнейшему ограничению азота путем ограничения поглощения глутамата и, таким образом, производя дальнейший метаболический стресс. Этот цикл приводит к распространению сигнала калия от клетки к клетке. D, минимальная модель, основанная на проводимости описывает динамику мембранного потенциала клетки в терминах одиночного калиевого канала и тока утечки. В соответствии с нашими экспериментальными результатами, эта простая модель имеет переходную деполяризацию с последующей гиперполяризацией в ответ на местный рост внеклеточной концентрации калия. Е, модель предсказывает, что манипулирование открытием канала и проводимость приведут к затуханию амплитуда пространственного распространения колебаний мембранного потенциала. F, максимальная интенсивность проекции изменений мембранного потенциала иллюстрирует ослабленную связь внутри биопленки в удаленном yugODtrkA в сравнении с биопленками дикого типа (вверху). Тепловая карта колебаний взята из дикого типа и мутантных  yugODtrkA биопленок (внизу).  Представленные изображения взяты из трех независимых экспериментов на биопленках, в которых биопленки дикого типа и  yugODtrkA сравниваются голова к голове. Измерительная шкала, 8 мм. G, количественное определение нормированной амплитуды импульса для дикого типа (n 5 8 импульсы) и yugODtrkA (n 5 12 импульсы) мутантных биопленок (имея в виду 6 s.e.m.). Обсуждение. Наши результаты показывают, что бактерия использует электрические сигналы, опосредованные калиевым ионным каналом для координации метаболизма в пределах биопленки. Последующая “пожарная цепочка” калиевого выпуска позволяет клеткам быстро сообщать их метаболическое состояние, пользуясь связью между мембранным потенциалом и метаболической активностью. Эта форма электрической коммуникации может таким образом усиливать ранее описанную метаболическую созависимость широкого радиуса в биопленках. В частности, волна деполяризации вызывает метаболическое напряжение внутренних клеток,  хотя предел возможностей клеток на периферии биопленки принимать глутамат или сохранять аммоний, позволяет внутренним клеткам иметь больше доступа к этим нутриентам. Это так же дает возможность объяснить наблюдение, в котором yugO-удаленный штамм имеет дефект в развитии биопленки. Интересно, что из-за быстрой диффузии ионов калия в водной среде, так же возможно, что даже физически разъединенные биопленки могут быть способны синхронизировать их метаболические колебания путем сходного обмена ионами калия. Роль электрической коммуникации опосредованной ионным каналом уже давно была оценена. При том, что, катионные каналы найдены во всех организмах и калий является доминирующим внутриклеточным катионом, электрическая передача обычно рассматривается как свойство нейронов. Тем не менее, некоторые недавние исследования показали, что в дополнение к традиционным системам коммуникации клетка-к-клетке, таким как чувство кворума, бактерия может использовать для коммуникации поток электронов. Описанное здесь исследование электрической координации метаболизма в микробных сообществах может в свою очередь ввести некоторые общие идеи, которые выходят за рамки бактерии. К примеру, связь между нейрональной передачей и метаболической активностью (нейрометаболизм) является активной областью исследований. Кроме того, истощение глутамата, наиболее распространенного возбуждающего нейротрансмитера, также формирует начальный триггер для этих коллективных метаболических колебаний, которые синхронизируются калием. Таким образом, это интригует, заставляя думать не только о структурных сходствах между бактериальными и человеческими ионными каналами, но и о их возможных функциональных сходствах в отношении электрической связи на дальние расстояния. Оригинал Перевод: Елена Лисицына