Ранние дивергентные штаммы Yersinia pestis в Евразии 5000 лет назад.
Автор: old.medach.pro
Публикация: 18.02.2018


Введение
Чума вызывается бактерией Yersinia pestis и передается непосредственно через контакт от человека к человеку (легочная чума) или через блох в качестве общего вектора (бубонная и септическая чума). Были задокументированы три исторические пандемии чумы человека: (1) первая пандемия, которая началась с чумы Юстиниана (541-544 гг. н. э.), но с перерывами продолжалась до 750 г. н. э.; (2) вторая пандемия, которая началась с “черной смерти” в Европе (1347-1351 гг. н. э.) и включила последующие волны, такие как “Великая чума” (1665-1666 гг. н. э.) вплоть до 18 века; (3) третья пандемия, которая возникла в Китае в 1850-х и разразилась там в крупную эпидемию в 1894 году, прежде чем распространилась по всему миру в виде ряда эпидемий вплоть до середины XX века. Возможно так же происходили ранние вспышки, такие как чума в Афинах (430-427 гг. до н. э.) и чума Антонина (165-180 гг. н. э.), но прямые доказательства, которые позволяют уверенно приписать их Y. pestis, отсутствуют. Последствия пандемии чумы были хорошо задокументированы и значительно повлияли на демографию. Одна “черная смерть” уничтожила, по оценкам, 30-50% населения Европы. Экономический и политический коллапсы, так же были частично отнесены к разрушительным последствиям чумы. Чума Юстиниана, как полагают, сыграла важную роль в ослаблении Византийской Империи, и предполагаемая ранее чума была связана с упадком Древней Греции и, вероятно, подорвала силы Римской армии. Оценки молекулярных часов позволяют предположить, что Y. pestis развилась из более распространенной и устойчивой к воздействию окружающей среды, но менее патогенной, кишечной бактерии Y. pseudotuberculosis между 2600 и 28000 лет назад. Тем не менее, предполагается, что люди начали контактировать с чумой гораздо раньше, чем появились исторические свидетельства этого, хотя прямые молекулярные доказательства Y. pestis не были получены из скелетного материала старше 1500 лет. Наиболее базальные штаммы Y. pestis (филогенетическая ветвь 0.РЕ7), записанные на сегодняшний день, были изолированны из Цинхай-Тибетского нагорья в Китае в 1961-1962 гг. Мы исследовали происхождение Y. pestis путем секвенирования древних бактериальных геномов из зубов людей Бронзового Века по всей Европе и Азии. Наши результаты показывают, что вирулентный, переносимый блохами штамм Y. pestis, который вызвал исторические пандемии бубонной чумы, произошел от менее патогеной линии Y. pestis, заражавшей популяции человека задолго до того, как были записаны свидетельства вспышек чумы.Результаты
Идентификация Yersinia pestis у индивидов Евразии Бронзового века.
Мы провели проверку приблизительно 89 миллиардов неочищенных последовательностей ДНК, выделенных из зубов 101 индивида Бронзового века из Европы и Азии, и у 7 человек обнаружили последовательности, похожие на таковые у Y. pestis. Кроме того секвенирование позволило нам собрать геномы Y. pestis средней глубиной 0,14-29,5Х с охватом 12-95% позиций в геноме по меньшей мере один раз.Мы так же установили последовательности трех плазмид: pCD1, pMT1 и pPCP1 (средней глубиной от 0,12 до 50,3Х), последние две из которых необходимы для дифференцировки Y. pestis от ее очень схожей предшественницы Y. pseudotuberculosis. Индивиды, из которых была выделена Y. pestis, относятся к евразийским культурам эпохи позднего Неолита и Бронзового века, таким как культура Афанасьево на Алтае, в Сибири (2782 cal BC, 2794 cal BC, n = 2), культура шнуровой керамики в Эстонии (2462 cal BC, n = 1), культура Синташта в России (2163 cal BC, n = 1), Унетицкая культура в Польше (2029 cal BC, n = 1), Андроновская культура на Алтае, в Сибири (1686 cal BC, n = 1), также в этой группе оказался один индивид эпохи Железного Века из Армении (951 cal BC, n = 1).Идентификация древней ДНК чумной палочки.
Помимо применения стандартных мер предосторожности при работе с древней ДНК, подлинность наших выводов поддерживают следующие наблюдения: (1) Последовательности Y. pestis были идентифицированы в значительных количествах в дробных данных в восьми образцах из 101, показывая, что эти находки не связаны с примесями в нашей лаборатории или в реагентах. Однако дальнейший анализ показал, что один из этих образцов на самом деле скорее всего не принадлежит Y. pestis. Мы также секвенировали все контрольные образцы негативной ДНК и не обнаружили в них никаких признаков Y. pestis. (2) В связи с древним происхождением, считываемые участки Y. pestis были сильно фрагментированы, со средней длиной считывания 43-65 п.н., кроме того, в них были обнаружены типичные для древней ДНК признаки дезаминирования C-T на 5’ концах. Поскольку для определения различий между Y. pestis и Y. pseudotuberculosis очень важны плазмиды, мы провели тест на обнаружение паттернов повреждения ДНК раздельно для хромосомы и плазмид. В семи образцах мы наблюдали аналогичные паттерны повреждения ДНК для хромосом и последовательностей плазмид. (3) Мы наблюдали корреляцию паттернов деградации моделей ДНК, когда сравнили деградацию ДНК в последовательностях Y. pestis и последовательностях человека, полученных из индивидов. Учитывая, что процесс распада ДНК имеет определенную скорость, можно сделать вывод, что молекулы ДНК патогена и восприимчивого человека имеют сходный возраст. Учитывая высокое сходство последовательностей Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, мы картировали полученный геном и сравнили его с референтными геномами Y. pestis CO92 и Y. pseudotuberculosis IP32953. В семи исследуемых образцах было обнаружено больше последовательностей, идеально совпадающих с таковыми у Y. pestis, что подтверждает принадлежность этих образцов к виду Y. pestis. Один из образцов (RISE392) в соответствии с эти критерием был не схож с Y. pestis. (5) Обученный на известных геномах интактный Байесовский классификатор предсказал, что семь образцов относятся к Y. pestis с апостериорной вероятностью 100%, в то время как RISE392 относится к Y. pestis с вероятностью 0%. (6) Если бы ДНК этого образца принадлежала другим организмам, а не Y. pestis, полученные в результате секвенирования последовательности чаще совпадали бы с высококонсервативными или простыми областями. Однако совпадающие последовательности были равномерно распределены по всему геному, и сравнение реальных совпадений с совпадениями, которые можно было бы ожидать исходя из распределения длины последовательностей и картирования референтных последовательностей, подтвердило, что образец не совпадает с остальными 7 образцами. (7) В максимально правдоподобной филогении, восстановленные геномные последовательности Y. pestis RISE505 и RISE509 явно находятся внутри филогенетической ветви Y. pestis и являются основой всех современных штаммов Y. pestis. Таблица 1. Обзор образцов содержащих Y. pestis.Образец | Страна | Место раскопок | Культура | Дата (до н. э.) | СО92 | рМТ1 | рРСР1 | рСD1 |
RISE00 | Эстония | Соуп | Шнуровая культура | 2575–2349 | 0.39 | 0.36 | 1.40 | 0.66 |
RISE139 | Польша | Кокцивель | Унетика | 2135–1923 | 0.14 | 0.24 | 0.76 | 0.28 |
RISE386 | Россия | Буланово | Синташта | 2280–2047 | 0.82 | 0.96 | 1.12 | 1.60 |
RISE397 | Армения | Капан | РЖВ | 1048–885 | 0.25 | 0.40 | 6.88 | 0.50 |
RISE505 | Россия | Китманово | Андроново | 1746–1626 | 8.73 | 9.15 | 34.09 | 17.46 |
RISE509 | Россия | Гора Афанасьево | Афанасьево | 2887–2677 | 29.45 | 16.96 | 31.22 | 50.32 |
RISE511 | Россия | Гора Афанасьево | Афанасьево | 2909–2679 | 0.20 | 0.24 | 1.19 | 0.60 |
Филогенетическое положение штаммов Yersinia pestis Бронзового века.
Чтобы определить филогенетическое положение двух штаммов Y. pestis - RISE505 (культура Андроново 1686 cal BC, 8.7X) and RISE509 (культура Афанасьево, 2746 cal BC, 29.7X), мы картировали считанные последовательности совместно с последовательностями штаммов Yersinia similis (n = 5), Y. pseudotuberculosis (n = 25) и Y. pestis (n = 139) и сравнили их с референтным геномом Y. pseudotuberculosis (IP32953). В расчетах были использованы только достоверные последовательности. Для определения инфицирования индивидов несколькими штаммами Y. pestis мы исследовали уровни гетерозиготности генотипов древних геномов и не обнаружили никаких признаков микст-инфекции. Снижения неравновесного сцепления генов обнаружено не было, что указывает на отсутствие рекомбинаций между штаммами. Потом мы использовали RAxML с целью построить максимально правдоподобное филогенетическое древо на основании суперматрицы, составленной из 3141 генов и, в общей сложности, 3,14 миллиона п.н. Этот анализ отличался от предыдущих попыток построить филогенетическое древо, в которых использовались менее 2300 п.н., которые, кроме того, вариабельны у Y. pestis, что, скорее всего, приводило к меньшей статистической точности, чем при полногеномном анализе. Кроме того, использование вариабельных у Y. pestis SNP привело к недооценке длины ветви Y. pseudotuberculosis и недооценке времени расхождения Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, что проявляется в длине ветви Y. pestis в сравнении с Y. pseudotuberculosis. Топология нашего полногеномного филогенетического древа представляет Y. pestis, как монофилетическую группу в пределах Y. pseudotuberculosis с кластерами RISE505 и RISE509 вместе в пределах филогенетической ветви Y. pestis. Топология суб-древа Y. pestis, аналогична определенной ранее, но с двумя древними штаммами (RISE505 and RISE509) лежащими в основе всех других известных штаммов Y. pestis (100% поддержка начальной загрузки).Определение сроков дивергенции Yersinia pestis.

Штаммы Yersinia pestis Бронзового века не имели мышиного токсина Yersinia
В высокоинтенсивных древних геномах Y. pestis мы исследовали наличие 55 генов, которые были ассоциированы с вирулентностью Y. pestis. Мы обнаружили все присутствующие гены вирулентности, за исключением гена мышиного токсина Yersinia (ymt), который локализован в 74,4-76,2 кб на плазмиде pMT1. Ген ymt кодирует фосфолипазу D, которая защищает Y. pestis внутри кишечника блохи, что позволяет этой кишечной бактерии использовать членистоногих как вектор; он также делает возможными более высокие титры Y. pestis и высшие скорости передачи. При исследовании всех семи образцов на наличие ymt мы определили, что область 19kb (59-78 кб) отсутствует, за исключением младших образцов (RISE397, 951 cal BC). Мы обнаружили, что эта область была представлена во всех других опубликованных штаммах Y. pestis (современных и древних), за исключением трех штаммов (5761, 945, and CA88), у которых полностью отсутствует плазмида рМТ1. Хотя для подтверждения и необходима выборка более крупных размеров, наши данные показывают, что ген ymt не был представлен в Y. pestis раньше 1686 года до н. э. (n = 6), в то время, как после 951 года до н. э. он найден в 97,8% штаммов (n = 140), что свидетельствует о позднем и очень быстром распространении ymt. Это противоречит предыдущим данным, которые говорили о том, что ген ymt возник в ходе эволюции Y. pestis достаточно рано из-за его важности в ее жизненном цикле. Интересно, что мы определили два элемента транспозазы по краям недостающей области 19 kb, что подтверждает, что ген ymt был приобретен посредством горизонтального переноса генов, как и предполагалось ранее. Кроме того, недавно было показано, что передача Y. pestis от блох так же зависит от функциональных мутаций в генах pde2, pde3 и rcsA. Образец RISE509 несет промоторную мутацию pde3 и функциональную pde2 и аллели rcsA. В комбинации с отсутствием ymt эти результаты всеми силами предполагают, что бактерия-предшественница Y. pestis не передалась индивидам раннего Бронзового Века от блох.
Ген нативного активатора плазминогена представлен в Yersinia pestis Бронзового века.
Другим знаковым геном патогенности Y. pestis является ген активатора плазминогена pla (белок семейства omptin), локализованный на плазмиде рРСР1 (6,6 - 7,6 kb). Ген способствует глубокой тканевой инвазии и играет важную роль в развитии бубонной и легочной чумы. Мы определили ген в шести геномах из семи , но не в RISE139, образце с самой низкой глубиной покрытия (0.75X на pPCP1). Недавно было предположено, что рРСР1 был приобретен после разветвления филогенетической ветви 0.РЕ2; однако мы определили рРСР1 в наших образцах, включая филогенетическую ветвь 0.РЕ7 (штаммы 620024 и CMCC05009), которые разошлись до возникновения общего предка ветви 0.РЕ2. Это показывает, что рРСР1 и pla присутствовали в самой базальной Y. pestis (RISE509), а штаммы 0.РЕ2 потеряли плазмиду рРСР1. Интересно, что в трех штаммах 2.ANT3 (5761, CMCC64001 и 735) ген pla также отсутствовал, что позволяет сделать вывод о том, что pPCP1 была потеряна в ходе эволюции Y. pestis несколько раз. Кроме того, мы исследовали, имеют ли RISE397, RISE505 и RISE509 смену изолейцина 259 на треонин в белке pla. Эта мутация, как было показано, имеет важное значение для развития бубонной, но не легочной, чумы. Мы обнаружили, что эти образцы, в соответствии с их базальной филогенетической позицией, несут родовой остаток изолейцина. Тем не менее, мы так же определили смену валина на изолейцин в положении 31 для RISE505 (1686 год до н. э.) и RISE509 (2746 год до н. э.). Эта мутация не была найдена ни в одном из других 140 штаммов Y. pestis, но была представлена в других белках omptin, таких как Escherichia coli и Citrobacter koseri, и, вполне вероятно, представляет собой древнее состояние Y. pestis. Самый молодой из образцов, RISE397 (951 год до н. э.) несет производный остаток изолейцина, показывая, что эта мутация, как и приобретение ymt, наблюдалась только после 1868 года до н. э. Альтернативное объяснение приобретениям мутаций ymt и pla I259T учитывает разнородные географические локации наших образцов, возможно, что Армянский штамм (RISE397, 951 год до н. э.), содержащий ymt и остаток изолейцина в pla, имеет долгую историю на Ближнем Востоке и распространился в ходе 1-го тысячелетия до нашей эры. Это привело бы к его распространению в Евразию и предположительному исчезновению других более древних и менее вирулентных штаммов Y. pestis.“Различная область 4” представлена в предковой Yersinia pestis
Кроме 55 генов патогенности, мы так же исследовали наличие “различной области 4” (DFR4), которая содержит несколько генов, потенциально играющих роль в вирулентности Y. pestis. Сообщалось, что эта область присутствовала в штаммах чумы Юстиниана и черной смерти, а затем была утеряна в референтном геноме СО92 (из третьей пандемии). В соответствии с родовой позицией наших образцов, мы нашли свидетельства тому, что область присутствует во всех наших семи образцах.В штаммах Бронзового века отсутствует жгутиковая мутация Yersinia pestis со сдвигом рамки считывания
Другой важной особенностью Y. pestis является способность уклоняться от иммунной системы млекопитающих. Флагеллин является мощным инициатором иммунной системы млекопитающих. Y. pseudotuberculosis, как известно, подавляет экспрессию жгутиковых систем в зависимости от температуры, а в случае Y. pestis ни один из известных штаммов не экспрессирует флагеллин, что обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в регуляторном гене flhD. Тем не менее, мы не нашли эту мутацию в RISE505 или RISE509, что позволяет сделать выводы о том, что они имеют полностью функциональные гены flhD и что потеря функции произошла после 2746 г. до н. э. Интересно, что самый младший из этих двух геномов Y. pestis (RISE505, 1686 год до н. э.) показывает частичную потерю одной из двух жгутиковых систем (758 - 806 kb) с удалением 39 из 49 генов. Эта делеция не была найдена ни в одном из других образцов Y. pestis (n = 147). Это может указывать на селективное давление возникшее, когда родовая Y. pestis стала патогеном млекопитающих, и переменно адаптивные штаммы уступили.
Обсуждение
В результате использования наших “откалиброванных молекулярных часов” были получены данные о том, что раннее ответвление Y. pestis произошло примерно 5783 года назад, что на 2000 лет раньше, чем предыдущие оценки. Кроме того, используя ДНК с известным возрастом, мы можем построить хронологию получения патогенных элементов и систем избегания иммунного надзора, которые способствовали эволюции менее вирулентных бактерий с зоонозным потенциалом, таких как Y. pseudotuberculosis, в одну из самых опасных бактерий, с которой когда-либо сталкивались люди. Из наших наблюдений, мы приходим к выводу, что предок сохранившихся штаммов Y. pestis присутствовал в конце 4-го тысячелетия до н. э. и был широко распространен по всей Евразии, по меньшей мере в начале 3-го тысячелетия до нашей эры. Возникновение чумы в пробах от индивидов из Евразии Бронзового века (7 из 101) указывает, что чумные инфекции возникали по меньшей мере на 3000 лет раньше, чем записано в истории. Однако, в отличие от более поздних линий Y. pestis, ответственных за первую, вторую и третью эпидемии, у этих древних бактерий отсутствовали важные гены вирулентности, поэтому они, скорее всего, не были способны вызывать бубонную чуму, ограничиваясь только легочной и септической формами. Эти ранние формы чумы возможно были ответственны за предполагаемое снижение популяции в конце 4-го-начале 3-го тысячелетий до нашей эры. Недавно в ходе исследования древних геномов было продемонстрировано, что Бронзовый век в Европе и Азии характеризовался крупномасштабными перемещениями популяций, смешением и заменами, которые сопровождались глубокими и хорошо описанными в ходе археологических исследований социальными и экономическими изменениями. В свете наших находок можно предположить, что вспышки чумы могли повлиять на эти динамичные демографические события (либо наоборот, эти демографические события могли увеличить вероятность развития вспышек чумы). Однако, исходя их наших данных можно сказать о том, что Y. pestis не адаптировалась с передачей с укусами блох до 1-го тысячелетия до нашей эры, что предшествует исторически описанным эпидемиям.
