Scott B. Vafai & Vamsi K. Mootha Большая часть наших сегодняшних знаний о митохондриях была получена при изучении пациентов, имеющих нарушения функционирования дыхательной цепи. Эти расстройства включают в себя широкий спектр редких синдромов, каждый из которых представлен уникальным и часто разрушительным процессом. В последние годы был достигнут значительный прогресс в определении их генетического базиса, но нам всё ещё мало известно о череде событий, которые дают толчок к развитию столь разнообразной патологии. В данном обзоре мы рассмотрим эти нарушения в контексте современного понимания эволюции, биохимии и генетики митохондрий. Полная расшифровка их патогенеза - это сложный следующий шаг, который послужит стимулом к разработке лекарственной терапии как редких, так и самых распространённых заболеваний. Митохондрии стали объектами медицинских исследований в 1959 году, когда шведский эндокринолог Рольф Луфт и его коллеги описали у женщины случай заболевания, сопровождавшегося эутиреоидным гиперметаболизмом, который характеризовался обильным потоотделением и потерей веса несмотря на большие количества потребляемых калорий . Биопсия мышц и анализ ферментов — которые сейчас являются главным элементом диагностики этих заболеваний — выявили митохондриальное разобщение у пациентки. Однако, описанный несколько десятилетий назад случай с тех пор был задокументирован лишь однажды , а основная причина болезни Луфта до сих пор остается тайной. Со времен описания первого клинического случая было определено более 150 различных генетических митохондриальных синдромов. Наибольшее число приходится на поражения, влияющие на функцию дыхательной цепи, которые возникают как минимум у 1 из 5000 живорожденных, о чем и пойдёт речь в этом обзоре. Эти заболевания могут проявляться в младенчестве или же у взрослого, а также быть тканеспецифичными или затрагивать работу многих систем орагнизма. Характерной чертой может стать лактатацидоз, миопатия скелетных мышц, глухота, слепота, подострая нейродегенерация, нарушение моторики кишечника и периферическая нейропатия. Большинство систем организма, в различных комбинациях, могут быть затронуты или же сбережены. (Рис. 1) Клинические признаки митохондриальных заболеваний были рассмотрены в деталях , однако были проиллюстрированы выборочные примеры. Наследственная оптическая нейропатия Лебера (НОНЛ), которая возникает в результате точечных мутаций повсеместно экспрессируемых генов митохондриальной ДНК (мтДНК), кодирующих белки дыхательной цепи, наглядно показывает высокую тканевую специфичность — у пациентов молодого возраста развивается внезапная потеря зрения. В сравнении, точечные мутации участков мтДНК, кодирующих транспортную РНК, вызывают митохондриальную миопатию, энцефалопатию, лактацидоз и инсульто-подобные эпизоды (MELAS), проявляясь мультисистемно - судорогами, нарушением слуха, инсульто-подобными эпизодами и лактатацидозом. Мутации кодируемой в ядре митохондриальной ДНК полимеразного гена POLG подчёркивают плейотропию: некоторые мутации приводят к лёгкой слабости глазных мышц, в то время как другие вызывают развитие синдрома Альперса (характеризуется психомоторной регрессией, судорогами и печёночной недостаточностью). Данные генетические расстройства могут имитироваться препаратами, которые имеют побочную токсичность. В 1995 году 2 фаза клинических испытаний фиалуридина — нового перспективного противовирусного препарата для лечения гепатита В — была остановлена после того, как препарат привёл к развитию лактатацидоза, миопатии, нейропатии и даже фатальной печёночной недостаточности у некоторых индивидов . Вместе с увеличением наших возможностей в определении генетических и экзогенных основ митохондриальных болезней, появились новые вопросы. Почему одни расстройства имеют высокую тканевую специфичность, а другие мультисистемны? Как могут мутации в белках “законсервированных бактерий”, приводящие к утрате функций, могут быть совместимыми с жизнью? Почему некоторые лекарственные препараты, которые ингибируют митохондрии, становятся причиной заболевания, в то время как другие ингибиторы защищают от них? Что лежит в основе спорадических случаев митохондриальных заболеваний? Ответы на многие из этих вопросов остаются тайной, но если их разрешить, они могли бы облегчить фундаментальное понимание метаболизма, привести к новым терапевтическим методикам и помочь нам установить точную роль митохондрий в развитии распространенных заболеваний. В этом обзоре мы охарактеризуем четыре ключевых свойства митохондрий а именно: их эволюционное происхождение, метаболические взаимосвязи, гетерогенность и устойчивость, которые помогут нам объяснить некоторые из таинственных особенностей этих расстройств. Мы рассмотрим свежие представления об их генетической архитектуре и новые представления об их патогенезе. В завершение мы обсудим проблемы и возможности, которые поставлены перед нами в этой относительно молодой области медицины.

Источник: журнал Nature a, Общие клинические проявления митохондриальных заболеваний. b, Изображение клинических проявлений у пациентов с различными митохондриальными расстройствами. По часовой стрелке, начиная с левого верхнего угла: на МРТ головного мозга, в режиме 3Т инверсии-восстановлении с ослаблением сигнала от жидкости, изображено поражение при синдроме Лейга, который здесь характеризуется билатеральным гиперинтенсивным сигналом в хвостатом ядре и скорлупе (стрелка) проникающим через базальный ганглий. Изображение сетчатки в острую фазу наследственной оптической нейропатии Лебера демонстрирует диск зрительного нерва с отеком волокон зрительного нерва, которые возникает за счет переполнения кровью затемненных сосудов (стрелка). "Рваные красные волокна" на срезе скелетных мышц наблюдаются при тройном окрашивании по Гомори (модификация). Передний отдел четырехкамерного поперечно рассеченного сердца, где можно увидеть признаки гипертрофической кардиомиопатии, среди которых кардиомегалия и асимметричная гипертрофия перегородки. Рентгенограмма брюшной полости в прямой проекции демонстрирует массивное вздутие кишечника (стрелка) при установленной хронической кишечной псевдонепроходимости, механическая обструкция не доказана. Аспирационный биоптат костного мозга, окрашенный железом для идентификации кольцевидных сидеробластов (стрелка) — характеризуется ореолом насыщенных железом митохондрий вокруг ядра клетки-предшественника эритроцита, полученных от пациента с миопатией, лактатацидозом и синдромом сидеробластической анемии.

Происхождение и эволюция митохондрий

Митохондрии имеют эндосимбиотическое происхождение и хранят в себе множество следов бактериальных предков, включая двойную мембрану и кольцевидную хромосому (мтДНК). Они сходны с микроорганизмами в том, что они, как правило, имеют масштаб около одного микрона и постоянно делятся, двигаются и сливаются, формируя динамичную сеть. Хотя митохондрии называют полуавтономными органеллами, миллиарды лет экспансивной и редуктивной эволюции (Рисунок 2а), сопровождаемой переносом большинства их генов в ядерный геном, эффективно и плотно встроили их внутрь эукариотических клеток. Человеческая мтДНК наследуется по материнской линии и кодирует только 13 белков, а также 22 гена тРНК и 2 гена рибосомальной РНК, которые необходимы для их трансляции. Все остальные белки, необходимые для сохранения целостности и экспрессии мтДНК, кодируются ядерным геномом. Большой прогресс был достигнут в изучении митохондриального протеома млекопитающих, где было определено более 1100 относящихся к этому компартменту белков . Интересно отметить, что мтДНК имеет монофилетическое происхождение , в то время как история митохондриального протеома гораздо более сложна . Из 1100 известных митохондриальных белков примерно две трети имеют бактериальное происхождение (вероятно, из нескольких фил), а остальная часть представлена эукариотическими новшествами. Мозаичная структура митохондрий проявляется в механизмах репликации и трансляции в органелле: рибосомы, очень похожи на их бактериальный аналог , а ДНК-полимераза, напоминает аналогичный фермент вирусного (бактериофагального) предка . Как будет показано ниже, молекулярные основы некоторых патологий митохондрий становятся ясны, когда учитывается происхождение органеллы. В ходе эволюции, органеллы уступали право собственности на одни сигнальные пути остальной части клетки, но в это же время, приобретали другие. Например, рибонуклеотидредуктаза, которая используется для синтеза дезоксирибонуклеотидов de novo, обнаруживается только в цитозоле, а дефицит этого фермента приводит к развитию синдрома истощения мтДНК . В других случаях, митохондрии сохранили копию цитозольного пути, например - тетрагидрофолат-зависимый одноуглеродный метаболизм . Эти паралогичные одноуглеродные пути, по всей видимости, имеют разное функциональное значение и могут быть особенно актуальны в течении таких заболеваний, как, например, рак . В настоящее время перед нами стоит проблема понимания логики компартментализации и паралогичных путей.

Дыхательная цепь и её взаимодействия

Сердцем митохондрии является дыхательная цепь - ключевой механизм окислительного фосфорилирования (Рисунок 2b). Обычно, дыхательная цепь включает в себя четыре макромолекулярных комплекса, которые катализируют перенос электронов от восстановленных в процессе промежуточного метаболизма соединений к кислороду. Благодаря транспорту электронов, комлексами I, III и IV формируется протонный градиент или протон-движущая сила (ПДС), которая используется для синтеза АТФ комплексом V - F1F0-АТФазой. Эти комплексы ассоциированы с внутренней мембраной и образованы примерно 90 белковыми компонентами, только 13 из которых кодируются мтДНК.Как правило, дыхательную цепь изображают изолированным механизмом в виде линейной цепи, на самом деле, дыхательная цепь - настоящий центр деятельности клеточного метаболизма, который характеризуется конвергенцией и дивергенцией путей, формированием суперкомплексов и обратимостью процессов. Почти все окислительно-восстановительные реакции в клетке в конечном счете связаны с дыхательной цепью (Рисунок 2b). Комплексы I и II опосредуют перенос двух электронов от, соответственно, НАДН и ФАДН2 к мобильному переносчику электронов — коэнзиму Q, обеспечивая связи с циклом трикарбоновых кислот (ЦТК). Коэнзим Q может также получать электроны из процессов биосинтеза пиримидина de novo, окисления жирных кислот и аминокислот, окисления холина (в конечном счете затрагивающего одноуглеродный метаболизм) и гликолиза. Комплекс III за счет Q-цикла представляет собой адаптор, который принимает два электрона от восстановленного коэнзима Q и переносит отдельные электроны к цитохрому С. Комплекс IV завершает дыхательную цепь, принимая электроны от цитохрома С и используя их для того, чтобы восстановить кислород до воды. Активные формы кислорода (АФК) - потенциально токсичные побочные продукты этих реакций (особенно в комплексах I и III), нейтрализуются благодаря выделению супероксиддисмутазы и каталазы, а также глутатиона, тиоредоксина и систем тиоловых белков. Нарушения в работе дыхательной цепи могут повлиять на нуклеотидные пулы, ЦТК , одноуглеродный метаболизм и сигналинг АФК, что определяет многочисленность сбоев в работе. ПДС больше всего известна благодаря синтезу АТФ, осуществляемому путем окислительного фосфорилирования, но она также связана с множеством других процессов (Рисунок 2b). Никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназа регенерирует митхондриальный НАДФН, который необходим для гомеостаза АФК, причем активность этого фермента связана с ПДС. Кроме того, ПДС связана с транспортом ионов и растворенных веществ через внутреннюю мембрану, а нарушение ПДС может остановить существующие биосинтетические реакции, такие как биогенез железосерных кластеров (Fe-S кластеры) и импорт белка. Важность ПДС обусловлена еще и тем фактом, что АТФ, полученная в результате гликолиза, может потребляться комплексом V, который работает в обратном направлении, защищая ПДС при ингибировании дыхательной цепи. Несмотря на то, что комплексы дыхательной цепи обычно изображаются, как свободно движущиеся в модели случайных столкновений , появляется всё больше доказательств в пользу модели состояния покоя , в которой отдельные комплексы физически сгруппированы в суперкомплексы (Прим. ред.: в русском языке эти модели называются "жидкая модель" и "цельная модель"). При разделении нативных белков в геле были продемонстрирована взаимодействия между комплексами I, III и IV . В принципе, такие ассоциации могут способствовать стабильности и прохождению субстрата с минимальным образованием АФК. Недавнее открытие генетических факторов, необходимых для сборки суперкомплексов , позволило тщательно оценить их роль в заболеваниях. Сравнительный анализ разных видов показывает, что большинство связанных с дыхательной цепью путей до сих пор не известны. Например, у человека комплекс I состоит из 45 субъединиц, включая 14 основных каталитических субъединиц, найденных и в бактериальном комплексе I. Недавно были выявлены кристаллические структуры комплекса I у Escherichia coli и Yarrowia lipolytica . Предполагаемый механизм возбуждения обеих структур показывает, что такие функции, как перенос электронов и перекачка протонов совершаются 14 древними субъединицами. Для служат остальные субъединицы? Основная гипотеза заключается в том, что они необходимы для сборки, стабилизации или регуляции, но хочется предположить, что комплекс I может служить базой для дополнительной ферментативной активности. Например, NDUFAB1 - одна из субъединиц, ассоциированных с комплексом I, имеет домен ацилпереносящего белка, участвующего во II типе синтеза жирных кислот . А последовательность аминокислот фактора сборки ACAD9 гомологична последовательностям дегидрогеназ очень длинноцепочечных жирных кислот . Кроме того, одна из субъединиц комплекса I обладает характерными филогенетическими особенностями ферментов, относящихся к окислению аминокислот с разветвленными боковыми цепями . Другие потенциальные побочные функции, которыми обладает комплекс I, требуют изучения и могут помочь нам понять плейотропные особенности, которые наблюдаются у пациентов.

Источник: журнал Nature a, На современном этапе в протеоме митохондрий человека насчитывается 13 белков, которые кодируют митохондриальную ДНК (мтДНК) и представляют собой рудимент оригинального протеобактериального генома, а также, как минимум 1100 дополнительных белков, которые, как известно, кодируются ядерным геномом (яДНК). Из этих белков, около 400 имеют протеобактериальное происхождение, которое было определено по сходству последовательностей с ближайшим нынеживущим потомком предковых протеобактерий - Rickettsia prowazekii , остальные предковые белки утрачены в ходе эволюции. Около 400 белков были получены от других бактериальных организмов - оценка проводилась путем определения численности митохондриальных белков, имеющих гомологи в других организмах. Около 300 белков не имеют гомологов среди других прокариотических организмов, они являются инновациями эукариот. b, Слева классическое изображение комплексов от I до V, с указанием количества субъединиц, кодируемых митохондриальной и ядерной ДНК. В центре представлены биохимические пути, которые объединены с потоком электронов в дыхательной цепи. Комплексы I и II переносят электроны, соответственно, от НАДН и ФАДН2 к коэнзиму Q, обеспечивая связь с циклом трикарбоновых кислот (ЦТК). Коэнзим Q дополнительно получает восстанавливающие эквиваленты, возникшие (1) в процессе гликолиза, благодаря митохондриальной глицерол-3-фосфат дегидрогеназе (ГФДГм), (2) в процессе синтеза пиримидина de novo пиримидином, фермент дегидрооротатдегидрогеназа (ДГОДГ), (3) в процессе окисления холина и в реакциях одноуглеродного метаболизма с помощью холиновой дегидрогеназы (ХДГ), а также (4) в процессе окисления жирных кислот и аминокислот электронпереносящей флавопротеин-дегидрогеназой (ЭФД). Справа представлены процессы, которые связаны с протонной движущей силой, включая образование АТФ с помощью комплекса V, транспортом кальция через унипорт (U), генерацией НАДФН с помощью никотинамиднуклеотид трансгидрогеназы (ННТ), обменом АТФ/АДФ с помощью транслоказы адениновых нуклеотидов, импортом белка через транслоказу внутренней митохондриальной мембраны (ВММ). Транспорт неорганического фосфата Pi через его носитель (Р). ΔΨm - мембранный потенциал митохондрии.

Митохондриальная гетерогенность

Степень специализации митохондрии в контексте каждой клетки остается недооцененной. В разных органах митохондрии демонстрируют разные паттерны выработки энергии и способности к биосинтезу. Например, митохондрии скелетных мышц способны окислять жирные кислоты, а митохондрии мозга могут окислять кетоны, в то время как митохондрии надпочечников высокоэффективны в отношении биосинтеза стероидных гормонов. Электронно-микроскопические исследования показали, что количество и морфология митохондрий может сильно отличаться в разных тканях (Рисунок 3а), за счет изменений, которые происходят в процессе развития и в ответ на воздействие окружающей среды. Даже в отдельных клетках митохондрии могут проявлять гетерогенность: интермиофибриллярные и субсарколеммальные митохондрии скелетных мышц имеют различные энергетические предпочтения и избирательно реагируют на физиологические и патологические воздействия . Что интересно, одна гипотеза предполагает, что сформировавшаяся в процессе эволюции мтДНК наделяет отдельные митохондрии способностью регулировать их локальный энергетический и окислительно-восстановительный статус, посредством локального контроля экспрессии генов - это так называемая гипотеза колокализации окислительно-восстановительной регуляции (Co-RR hypothesis) . В недавных протеомных исследованиях митохондрий различных органов была подсчитана степень молекулярной гетерогенности: обнаружено, что 75% компонентов у митохондрий из двух разных органов схожи . Подобная тканевая гетерогенность ведет ко множеству функциональных последствий . Например, в то время как большинство комплексов дыхательной цепи неизменно в различных органах, комплекс IV имеет тканеспецифичные изоформы , которые ранее позиционировались как решающие для ответа на локальное напряжение кислорода . Митохондриальные рибосомы служат для трансляции 13 субъединиц дыхательной цепи, кодируемых мтДНК . Все они важны и были обнаружены во всех тканях. В то же время, белковый состав митохондриальных рибосом отличается поразительным тканевым разнообразием , значение которого в настоящее время неизвестно. Заманчиво предположить, что подобное непостоянство способствует тканеспецифичному эффекту мутаций мтДНК. Наиболее любопытной областью изучения биологии митохондрий является понимание регуляторных механизмов, дающих начало тканевой и клеточной гетерогенности (Рисунок 3b). Эти механизмы можно сгруппировать в четыре обширные категории, каждая из которых будет рассмотрена отдельно: биогенез органеллы , передвижение , слияние и деление , митофагия . Колокализация окислительно-восстановительной регуляции, в принципе, может способствовать внутриклеточной гетерогенности, но до сих пор понятны далеко не все молекулярные механизмы и эта гипотеза нуждается в тщательной проверке. Мутации, влияющие на эти регуляторные механизмы, уже обнаружены, также они могут быть причинами некоторых болезней. Например, мутации в необходимых для слияния митохондрий MFN2 и ОРА1, приводят к развитию 2А типа болезни Шарко-Мари-Тута и аутосомно-доминантной атрофии зрительного нерва, соответственно. PINK1 и parkin необходимы для митофагии, а их мутации вызывают менделевскую форму болезни Паркинсона.

Устойчивость

Митохондриальная дыхательная цепь - это устойчивая система, которая приспособлена работать в условиях изменения доступности питательных веществ. Митохондрии сердца представляют собой яркий пример устойчивости - они способны поддерживать постоянное соотношение АТФ/АДФ, в пятикратном динамическом диапазоне рабочей нагрузки во время физических упражнений in vivo . Были идентифицированы два механизма, лежащих в основе этой регуляции. Во-первых, Chance и Williams в первых исследованиях изолированных митохондрий продемонстрировали в разных экспериментальных условиях, что скорость дыхания и синтеза АТФ в значительной степени контролируется наличием АДФ, данный механизм обратной связи авторы назвали “дыхательный контроль”. Вторым механизмом является прямое воздействие кальция, которое обеспечивает согласованное использование АТФ в цитозоле и его производство в митохондриях . Многие цитозольные процессы, такие как нейротрансмиссия и сокращение мышц, возникают в результате повышения концентрации кальция в цитозоле, и этот же кальциевый сигнал может передаваться через унипорт в матрикс, стимулируя ЦТК, чтобы обеспечить производство/продукцию АТФ. Вероятно, эта устойчивость характерна для всей дыхательной цепи и многочисленных реакций, сопряженных с нею, о чем свидетельствуют классические исследования анализов метаболического контроля (АМК) . АМК обеспечивают экспериментальную и теоретическую базу, которая помогает понять свойство системы контролирующей поток. Для потоковой системы J, коэффициент контроля CJ Ei, осуществляемый с помощью фермента Ei, определяется как (ΔJ/J)/(ΔEi /Ei ), где ΣCJ Ei = 1. CJ Ei обозначает процент контроля, осуществляемого одиночным ферментом в системе. В эксперименте небольшие молекулы могут быть использованы для модуляции Ei, пока J измеряется. АМК был использован , чтобы показать, что дыхательный контроль широко распространен, а интервал, в котором он функционирует, помимо прочего, зависит от рабочей нагрузки. Важным следствием такой работы является то, что режим активности комплекса дыхательной цепи может широко варьировать, не затрагивая при этом общее дыхание (Рисунок 3с). Устойчивость митохондриального метаболизма имеет важное значение для понимания заболеваний . Во-первых, устойчивость может быть основанием для того, чтобы даже тяжелые мутации могли быть допустимы в системе окислительного фосфорилирования и не оказывать летального воздействия. Устойчивость митохондрий означает, что система может быть толерантна к гипоморфным аллелям, при наличии определенных факторов окружающией среды, стресса или вторичных генетических повреждений могут служить причиной болезни. Было показано, что коэффициенты регулирования различных комплексов дыхательной цепи варьируют в различных тканях крыс (Рисунок 3с), позволяя предположить, что тканеспецифичные коэффициенты регулирования воздействуют, когда патология проявляется. Тем не менее, эта заманчивая гипотеза все еще нуждается в формальных доказательствах.

Источник: журнал Nature а, Электронная микрофотография митохондрий различных тканей, подчеркивающая их тканевое разнообразие (Шкала - 200 нм). b, Процессы, которые приводят к формированию митохондриальной гетерогенности в различных тканях и клетках: движение, биогенез, митофагия, слияние/деление. Перечислены основные регуляторы этих процессов. белок DRP1 кодируемый DNM1L, далее по аналогии; ERRα кодируемый ESRRA; FIS1 кодируемый FIS1; FUNDC1 кодируемый FUNDC1; GABPA кодируемый GABPA; MFF кодируемый MFF; MFN1 кодируемый MFN1; MFN2 кодируемый MFN2; MiD49 кодируемый SMCR7; MiD51 кодируемый SMCR7L; Milton, который представляет семейство белков Milton, кодируемых TRAK1 и TRAK2 у людей; Miro, который представляет семейство белков Мiro, кодируемых RHOT1 и RHOT2 у людей; NIX кодируемый BNIP3L; NRF1 кодируемый NRF1; OPA1 кодируемый OPA1; Parkin кодируемый PARK2; PGC1α кодируемый PPARGC1A; PGC1β кодируемый PPARGC1B и PINK1 кодируемый PINK1. с, Интенсивность дыхания в митохондриях, изолированных из пяти типов тканей крыс, у которых комплекс IV был ингибирован в той или иной степени с помощью KCN. Интенсивность выражается как процент от интенсивности дыхания в контрольных митохондриях из той же ткани, но не обработанных KCN .. с, Темп дыхания в митохондриях, изолированных из пяти типов тканей крыс, с комплексом IV, ингибированным с KCN в той или иной степени. Скорость выражается в частоте дыхания не подвергшихся изменениям митохондрий данной ткани .

Генетика митохондриальных расстройств

За последние 25 лет исследования отдельных пациентов и семей, которые страдали митохондриальными заболеваниями, позволили в достаточной мере понять их генетическую основу. Данные генетически повреждения могут находиться в мтДНК и ядерной ДНК и проявляться в путях, которые поддерживают сборку и активность дыхательной цепи (Рисунок 4 и Таблица 1). Также, эти генетические исследования помогли расширить фенотипический спектр митохондриальных расстройств.

Источник: журнал Nature Гены, мутации в которых ведут к заболеваниям, связанным с нарушениями дыхательной цепи, можно сгруппировать в пять больших категорий на основании путей, в которых они участвуют. Продукты генов, идентифицированные на сегодняшний день, сгруппированы в Таблице 1 и включают те из них, что вовлечены в индивидуальные нарушения субъединиц комплексов l-V, которые участвуют непосредственно в окислительном фосфорилировании; белки, вовлеченные в репликацию мтДНК, транскрипцию и трансляцию; белки, участвующие в сборке комплексов окислительного-фосфорилирования; митохондриальные белки импорта и белки гомеостаза (сгруппированы по пути окислительного фосфорилирования, биогенеза и регуляции); белки, которые участвуют в транспорте нуклеотидов и синтезе, а также белки, которые участвуют в контроле структуры мембраны и ее динамики . Мутации в мтДНК Секвенирование человеческой мтДНК в 1981 году послужило толчком к началу молекулярной эры митохондриальной медицины. Два особо значимых документа 1988 года отмечают точечные мутации и делеции в мтДНК при НОНЛ и митохондриальной миопатии, соответственно. С тех пор больше 300 точечных мутаций, делеций и дупликаций были ассоциированы с большим разнообразием симптомов (http://old.www.mitomap.org). МтДНК имеет ооцитарное происхождение, а потому наследование этих нарушений происходит от матери. Хотя некоторые расстройства мтДНК (такие как НОНЛ) гомоплазмические, другие (такие как MELAS) гетероплазмические. При гетероплазмических расстройства, клетки содержат смесь молекул мтДНК дикого типа и мутантных, а заболевание проявляется только когда нагрузка мутантной мтДНК превышает пороговое значение. Стохастическое распределение молекул ДНК в процессе развития может стать причиной вариабельной тканевой экспрессии заболевания. Мутации в ядерных генах В 1995 году была идентифицирована первая мутация ядерного гена, лежащая в основе митохондриального расстройства, когда группы Муниха (Munnich) и Рётига (RÖtig) отметили мутацию SDHA у пациента с дефицитом комплекса II и синдромом Лейха . Секвенирование человеческого генома, в комбинации с характеристикой митохондриального протеома , послужило толчком к открытию генов ядерных заболеваний и путей, которые необходимы для сборки и функционирования дыхательной цепи. На основании последних обзоров и баз данных заболеваний (http://old.omim.org), в настоящее время открыто более 110 ядерных генов, число которых стремительно растет. Мутируя, они могут приводить к патологии дыхательной цепи. Идентифицированные гены могут быть организованы в пять обширных путей, вовлеченных в экспрессию, сборку и активность системы окислительного фосфорилирования (Рисунок 4 и Таблица 1). Мутации т-РНК синтетазы, гены которой находятся в ядерной ДНК, подчеркивают фенотипическую гетерогенность, которая может быть ассоциирована с тем же путем. Хотя все эти генные продукты способствуют трансляции 13 закодированных в мтДНК белков дыхательной цепи, их клинические проявления весьма разнообразны . Например, мутации в EARS2 проявляется как лейкоэнцефалопатия и увеличение концентрации лактата в цереброспинальной жидкости, в YARS2, как миопатия и сидеробластическая анемия, в HARS2, как недостаточность функции яичников, в AARS2, как гипертрофическая кардиомиопатия и в SARS2, как легочная гипертензия и почечная недостаточность. Более того, эти фенотипы не совпадают с таковыми, возникающими при мутациях соответствующих тРНК, которые кодируются митохондриальным геномом Митохондриальная гетерогенность, возможно, на уровне кодируемых в ядре митохондриальных рибосом , или сумрачная роль тРНК-синтетазы может лежать в основе тканеспецифичной патологии. Несмотря на то, что большинство ядерных генов, которые лежат в основе заболеваний, связанных с нарушением работы дыхательной цепи, кодируют митохондриальных белки, небольшая группа не предоставляет полезной информации об уровне перекрестных помех между органеллой и остальной частью клетки. Например, как уже упоминалось, надлежащий нуклеотидный гомеостаз митохондрии зависим от некоторых цитозольных путей, а мутации в генах, которые кодируют рибонуклеотид-редуктазу (RRM2B) и тимидинфосфорилазу (TYMP) , нарушают функционирование мтДНК. Мутации в гене WFS1, который кодирует резидентный белок эндоплазматического ретикулума, вызывает синдром Вольфрама, который характеризуется глухотой, сахарным диабетом, несахарным диабетом и атрофией зрительного нерва. Формально не классифицирующиеся как митохондриальное расстройство, фенотипическое перекрытие и наличие делеций в мтДНК у некоторых пациентов позволило предположить, что WFS1 опосредует взаимодействия между эндоплазматическим ретикуломом и митохондрией . Эта гипотеза подтверждается исследованиями, проведенными на Saccharomyces cerevisiae, где компонент соприкасающейся структуры - эндоплазматический ретикулум-митохондрия , МММ1 локализован совместно с нуклеоидами мтДНК и играет роль в стабильности мтДНК . Мы ожидаем, что исследования в области генетики митохондриальных расстройств будут продолжать выявлять неожиданные связи, как физические, так и функциональные, между митохондрией и остальной частью клетки. Модуляторы из окружающей среды Факторы окружающей среды могут влиять на течение генетических митохондриальных расстройств и даже фенокопировать их. Например, табакокурение и чрезмерное употребление алкоголя являются факторами риска потери зрения при НОНЛ . Воздействие токсичных веществ может привести к развитию патологии, которая напоминает НОНЛ, как это произошло во время “эпидемии слепоты” на Кубе в начале 1990 годов. В итоге причиной оказался широко распространенный дефицит фолата в комбинации с токсичностью метанола, содержавшегося в самодельном роме . Формиат - побочный продукт метаболизма метанола, аккумулируется в условиях дефицита фолата и ингибирует комплекс IV. Давно известно, что некоторые препараты оказывают токсический эффект на митохондриальную функцию. Благодаря бактериальному происхождению митохондриальных рибосом, на трансляцию мтДНК могут негативно воздействовать такие антибиотики, как аминогликозиды, которые, при введении высоких доз, могут стать причиной нейросенсорной глухоты. Лица с определенными мутациями в участке мтДНК, кодирующем 12S субъединицы рибосомной рРНК - распрострененность в популяции составляет 0,19% - предрасположены к развитию глухоты после приема аминогликозидов, потеря слуха у них может развиться даже при кратковременном приеме рекомендуемых доз . Вирусное происхождение митохондриальной ДНК-полимеразы делает ее восприимчивой к противовирусным аналогам нуклеозидов (включая фиалуридин). Этот класс препаратов обычно используется в борьбе с ВИЧ и может вызывать такие эффекты, как лактацидоз за счет истощения мтДНК . Микроорганизмы, начиная от кишечной микробиоты и заканчивая вирусами, - это находящийся на стадии становления класс модификаторов внешней среды. Кишечные бактерии - ключевое звено в прогрессировании такого заболевания, как этилмалоническая энцефалопатия. Ген - ЕТНЕ1 кодирует фермент, который нейтрализует соединения серы, вырабатываемые кишечной микрофлорой, а его утрата приводит к аккумуляции H2S, с последующим ингибированием комплекса IV и короткоцепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы. Лечение метронидазолом (противомикробный препарат, который снижает количество кишечных микроорганизмов) и N-ацетилцистеином (способствует глутатион-опосредованной детоксикации H2S) приводит к клиническому улучшению . Хотя роль вирусных инфекций в развитии митохондриальных нарушений не была обнаружена, экспериментальные исследования указывают на то, что некоторые вирусы, такие как ВИЧ , могут модулировать активность комплекса I. Неразгаданные случаи митохондриальных заболеваний За последние 25 лет большинство генов, отвечающих за развитие митохондриальных заболеваний, были идентифицированы в семейных формах заболеваний, в которых можно проследить сегрегацию высоко пенетрантных причинных аллелей. Основываясь на опыте, полученном нами в центральной больнице штата Массачусетс, мы определили что меньше 25% пациентов с клиническими и биохимическими маркерами митохондриальных заболеваний имеют убедительные доказательства относительно поражения первой или второй степени. Некоторые недавние исследования использовали экзомное секвенирование в целях молекулярной диагностики единичных случаев . Но вероятность успеха и полученный опыт не оправдали ожиданий. Наш опыт показал, что при биохимически подтвержденном тяжелом случае заболевания у младенцев, поставить диагноз с помощью секвенирования экзома можно лишь в половине случаев . Однако, по прогнозам, вероятность успеха будет гораздо ниже в легких случаях заболевания и у взрослых. Как мы можем объяснить эти неразгаданные случаи? Большинство экзомных исследований единичных случаев были направлены на идентификацию рецессивных мутаций в митохондриальных белках. Вполне возможно, что эти неразгаданные случаи - результат доминантных, едва заметных рецессивных или регуляторных мутаций с неполной пенетрантностью, которые сложно идентифицировать из-за фонового полиморфизма. Как альтернатива, эти случаи могут произойти из-за мутаций в областях ДНК, которые не были целью секвенирования. Некоторые случаи также могут иметь чисто экологические причины, как в случае эпидемии слепоты на Кубе. Заманчивая возможность заключается в том, что подмножество этих неразгаданных случаев связано со сложным генетическим наследованием: результатом взаимодействия между вариантами генов, каждый из которых имеет ослабляющий или усиливающий эффект, является так называемая синергичная гетерозиготность .По результатам таргетного экзомного секвенирования было отмечено, что что в здоровом контроле есть 15-20 аллелей в гетерозиготном состоянии, которые могут приводить к потери функции кодируемых ими белков митохондриального протеома . Толерантность к высокому грузу вредоносных аллелей, вероятно, развивается из-за надежности митохондриальных сетей. Однако возможно, что мутации, которые влияют на полимерные гены, работающие в одних и тех же или в параллельных путях, могут в комбинации приводить к патологии. Наводят на мысль данные в поддержку синергических взаимодействий между мтДНК и вариантами ядерной ДНК . Определение генетической основы многочисленных нераскрытых спорадических случаев митохондриальных заболеваний представляют собой одну из главных проблем митохондриальной генетики.

Таблица 1 | Продукты генов, которые известны, как мутирующие в заболеваниях, вызванных нарушениями дыхательной цепи, сгруппированные по метаболическим путям Источник: журнал Nature

Митохондриальные колебания и ответы

Несмотря на значительный прогресс в определении генов и триггерных факторов окружающей среды, которые лежат в основе митохондриальных заболеваний, их патогенез остается загадкой. Многие медицинские учебники предлагают слишком упрощенные объяснения: болезнь поражает ткани с наибольшей потребностью в АТФ, или развивается вследствие окислительного повреждения. Вероятно, эти факторы способствуют заболеванию, но общая картина гораздо более сложная. Клеточные модели заболевания указывают, что имеется заметный потенциал для сохранения продукции АТФ путем увеличения темпов гликолиза , и, на моделях животных с дисфункцией дыхательной цепи, патология может развиваться без значительного увеличения оксидативного повреждения . Кроме того, тот факт, что ингибирование дыхания может быть допустимо, а в некоторых условиях даже полезно (Вкладка 1), указывает, что последствия поражений дыхательной цепи не одинаково плохи, и предполагает вовлечение нелинейных моделей патогенеза и пороговых эффектов. Для последовательного понимания патогенеза, стоит рассмотреть последствия поражений проксимальных участков дыхательной цепи — или митохондриальные колебания — и вторичные клеточные реакции, которые они вызывают. Исследования на модельных организмах обеспечивают несколько примеров таких каскадов типа “колебания-ответ”. Ретроградный ответ у S. cerevisiae представляет собой определенный транскрипционный ответ, который позволяет этому организму выжить в условиях замедления работы дыхательной цепи, в основном путем компенсации неполных функций ЦТК, поддерживая продукцию таких метаболитов, как глутамат . Точные колебания, которые вызывают ретроградный ответ у дрожжей остаются неизвестными, хотя утрата ПДС, как полагают, играет ключевую роль . У плодовой мушки, Drosophila melanogaster, нарушения в дыхательной цепи могут вызвать блокаду перехода клеточного цикла от G1 к S, посредством двух возможных путей типа “волнение-ответ”: мутация субъединицы комплекса I приводит к АФК-опосредованной активации сигналинга JNK , в то время, как уменьшение продукции АТФ в результате мутации комплекса IV вызывает активацию AMПК (АМФ-активируемая протеинкиназа) . Исследования круглого червя Caenorhabditis elegans обнаружили в митохондриях ответ на несложенные белки (мхОНБ), который активируется при нарушении белкового гомеостаза, в результате нанося ущерб дыхательной цепи . МхОНБ включает повышение экспрессии митохондриальных шаперонов и, в частности, мутации, затрагивающие компонеты этого пути, могут привести к развитию некоторых нейродегенеративных нарушений . Разработкина основе данных о модельных организмах, привели к выводу о том, что в результате поражений дыхательной цепи может возникнуть широкий спектр пар “волнение-ответ”, и эти пары придают удивительную устойчивость к подобным нежелательным воздействиям. Однако, некоторые из них могут быть адаптивными на короткий срок, а с течением времени индуцировать разные патологии. Метаболомные исследования были попыткой систематизации разных биохимических волнений, которые происходят из-за ингибирования дыхательной цепи. Одно исследование характеризует эффект небольших молекул-ингибиторов дыхательной цепи на поток метаболитов в культуре клеток и соотносит эти изменения с измерениями параметров плазмы пациента. Специфическая блокада комплекса III привела к снижению синтеза уридина, что согласуется с давним наблюдением о том, что клетки с дефектной дыхательной цепью — уридиновые ауксотрофы . Секреция лактата подчеркивает, что индукция реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой является средством поддержки продукции АТФ в процессе гликолиза и потребления НАДН, поддерживая баланс окислительно-восстановительных кофакторов. В другом исследовании отмечено, что обратный поток через ЦТК, а именно снижение карбоксилирования α-кетоглутарата в изоцитрат является ответом на ингибирование дыхательной цепи . В идеале, исследование каскадов “волнение-ответ” может объяснить причину патологий. В один из перспективных каскадов вовлечен кальций. Митохондрии играют важную роль в формировании концентрации кальция в цитозоле, посредством поглощения через унипорт , этот процесс зависит от интактной ПДС. Различные исследования сошлись на механизме, который, снижая митохондриальную ПДС, вторично повышает концентрации цитозольного кальция — это ключевой промежуточный сигнал в ответ на повреждение дыхательной цепи посредством активации кальций-чувствительных сигнальных факторов (таких как кальцинейрин и кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа IV (СаМКIV) ). Мы предположили, что активация кальций-зависимого сигналинга поможет объяснить некоторые ключевые признаки патологии (Рисунок 1). Например, активация СаМКIV может индуцировать митохондриальный биогенез , потенциально способствуя обнаружению “неровных красных волокон”, которые также часто наблюдаются при биопсии скелетных мышц. Активация кальцинейрина также участвует в индукции гипертрофической кардиомиопатии . Изменение динамики кальция в интерстициальных клетках Кахаля, полученных из желудочно-кишечного тракта, ставило под угрозу их пейсмейкерную активность и это могло способствовать кишечной псевдонепроходимости (Рисунок 1b). Однако, не все мутации дыхательной цепи нарушают кальциевый гомеостаз . Более того, кальциевые потоки в митохондриях могут варьировать в зависимости от ткани и это может формировать паттерн тканевой экспрессии. Каскады “волнение-ответ” могут протекать вне клеток, что приводит к неклеточным автономным эффектам. Лактацидоз — это лучший из известных примеров, который может привести к нарушению работы многих органов путем снижения рН сыворотки крови. Фактор роста фибробластов 21 — гормон, который опосредует реакции на голод, высвобождается из скелетных мышц пациентов с митохондриальной миопатией . Это привело к интригующей гипотезе о том, что этот процесс может быть двигателем системной метаболической патологии. Свежие данные указывают на решающую роль митохондрий в регуляции врожденного иммунитета . Однако, роль самих органелл в митохондриальных расстройствах изучена не до конца. Хотя ингибирование дыхательной цепи часто рассматривается как нежелательное, несколько наблюдений позволили предположить, что в определенных случаях последствия могут быть полезны. Метформин - наиболее часто назначаемый для лечения сахарного диабета 2 типа препарат - ингибирует комплекс I. Этот биоэнергетический эффект, как полагают, способствует торможению в печени глюконеогенеза . Лактатацидоз является известным, хоть и редким, побочным эффектом метформина, подчеркивая тонкий баланс между терапевтическим и токсическим эффектами ингибирования дыхательной цепи. Предварительное лечение низкомолекулярными ингибиторами дыхательной цепи может защитить такие органы, как мозг и сердце от повреждений, вызванных реперфузией и ишемией . И наконец, данные исследований как на круглом черве Caenorhabditis elegans , так и на плодовой мушке Drosophila melanogaster показывают, что опосредованный РНК-интерференцией нокдаун различных компонентов дыхательной цепи продлевает жизнь. Общим для всех этих наблюдений является то, что последствия умеренного торможения дыхательной цепи для клеток и организма могут быть использованы в терапевтических целях - концепция митохондриального гормезиса. Мы подозреваем, что терапевтические эффекты возникают, когда при поражении дыхательной цепи перевешивает гомеостаз, а не патогенез.

Перспективы и проблемы последующих исследований

Понимание патогенеза митохондриальных расстройств — это новая область исследований с огромным количеством возможностей. Во-первых, эти расстройства возникают, как минимум, в 1 случае на 5000 здоровых индивидов и не имеют доказанных средств лечения . Следовательно, существует уникальная возможность развития терапевтических методик для пациентов, которые, в противном случае, имеют удручающие прогнозы. Во-вторых, эти расстройства позволяют погружаться в основы клеточной биологии, и многое из того, что мы знаем о сборке дыхательной цепи и компартментализации метаболизма было обнаружено именно в таких ситуациях. И, наконец, имеется большой интерес к роли митохондрий во многих распространенных заболеваниях человека, этот интерес подпитывается наблюдением, что множество распространенных дегенеративных расстройств ассоциированы с количественным упадком митохондриальной активности. Однако, отличительная причина из корреляции — это сложная задача, а митохондриальные расстройства могут быть ценным инструментом для выяснения роли органеллы в общей патологии. Опираясь на эти возможности, мы рассмотрим необходимость расшифровки патогенеза этих орфанных заболеваний. Мы ожидаем, что для решения этой задачи потребуются две взаимодополняющих линии исследований — изучение клетки и пациента. Во-первых, это будет иметь важное значение для характеристики свойств сетевого уровня митохондрии в клеточных исследованиях. В результате классических биохимических исследований и (более поздних) протеомных исследований митохондриальных изолятов мы приобрели достаточно знаний о белковых компонентах органеллы и разнообразии реакций, а также теоретическую основу для понимания регуляторного контроля.Развиваясь, это будет иметь решающее значение для создания карты взаимодействий всех этих компонентов, как на физиологическом, так и на генетическом уровнях среди клеток различных типов. В этой области уже достигнут первоначальный прогресс, недавно была создана генетическая карта взаимодействий, основанная на исследованиях митохондрий S. cerevisiae . Богатая эволюционная история митохондрий и интересные особенности регуляции транскрипции мтДНК будут способствовать вычислительной идентификации модулей функциональных взаимодействий генов . Такие сетевые карты позволят выявить механизмы гомеостаза, которые создают защитную зону от экологических или генетических повреждений. Во-вторых, параллельно, это будет иметь решающее значение для каталогизации генотипов и фенотипов отдельных пациентов по всему миру. Технологии секвенирования нового поколения уже облегчили секвенирование геномов пациентов, в то время как интернет и поддержка беспроводных технологий подарят нам расширенную информацию о фенотипах с беспрецедентным временным разрешением. Поскольку индивидуальные митохондриальные расстройства редки и разнообразны, мы ожидаем, что общедоступные, объединенные модели, в которых пациенты и доктора являются партнерами в биомедицинском исследовании, сделают так, что данные будут объединены и использованы для обнаружения необходимый информации. Метаболические профили, культур клеток, несущих патологию, а также плазмы крови человека, могут быть ключевым компонентом для связи данных на уровне клетки и на уровне пациента в моделях прогнозирования патогенеза. Идентификация связи между генотипом и фенотипом — сложная задача в исследовании всех болезней. Но уникальные особенности митохондрий — их относительно хорошо изученная биохимия, практически полный каталог их белков, возможность изучать митохондрии в изолятах или in situ, огромное число моногенных нарушений, а также активное и заинтересованное сообщество пациентов — предоставляют ключевые преимущества, которые помещают эти органеллы на передовую линию развивающейся области медицинской системной биологии. Исследования орфанных митохондриальных нарушенией будут ключевым звеном в решении одной из множества важных проблем фундаментального метаболизма - логики компартментализации. Почему некоторые пути продолжают существовать в митохондриях, в то время, как другие продублированы или переместились в цитозоль? Митохондрии сохранили характерный для бактерий II тип пути синтеза жирных кислот, а также запасную версию тетрагидрофолат-зависимого одноуглеродного метаболизма и фермент глюконеогенеза — фосфоэнолпируват карбоксикиназу. Какие преимущества предоставляют приобретение или утрата подобных путей? Мы полагаем, что исследования редких митохондриальных нарушений прольют свет на значение этих путей in vivo, а также на обстоятельства, в которых эти пути действуют. Новые пути измерения компартмент-специфического метаболизма как в культуре клеток, так и in vivo, обязательно поспособствуют развитию этой области. Мы можем оптимистично верить, что понимание митохондриального патогенеза будет способствовать развитию новых терапевтических методик для этих разрушительных расстройств, среди которых некоторые разновидности могут использоваться и для терапии распространенных заболеваний. Примером такого перепрофилирования служит история дихлорацетата, небольшой молекулы, которая снижает продукцию молочной кислоты, стимулируя пируватдегидрогеназу. Дихлорацетат был протестирован как средство для лечения лактатацидоза, вызванного митохондриальными заболеваниями, но имел недостаточную клиническую эффективность и вызывал нежелательные токсические эффекты . Несмотря на то, что препарат потерпел значительную неудачу как средство для терапии митохондриальных расстройств, он сейчас тестируется в клинических испытаниях терапии некоторых видов злокачественных опухолей. Многие из них имеют повышенную зависимость от аэробного гликолиза с сопутствующей продукцией лактата — так называемый эффект Варбурга. Дихлорацетат используется для того, чтобы обратить этот ключевой признак метаболизма, а первые результаты клинических испытаний на людях были многообещающими . Мы ожидаем, что эта тенденция продолжится и развитие препаратов для лечения митохондриальных заболеваний, в конечном счете, окажется полезным для пациентов с этими редкими заболеваниями, а также для других пациентов, с более распространенной патологией. Оригинал Перевод: Елена Лисицына Изображения: Антон Осипенко Редакция: Николай Лисицкий, Полина Тиканова