Xin Ye and Robert A. Weinberg Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) – основной фактор, обуславливающий злокачественность опухолей. Более того, недавно была открыта связь между процессами ЭМП и приобретением клетками стволовых свойств. Это позволяет сделать вывод о том, что ЭМП является основным механизмом, приводящим к появлению опухолевых стволовых клеток (ОСК), т.е. той субпопуляции опухолевых клеток, которые обуславливают инициацию и развитие заболевания. В этом обзоре мы поговорим о доказательствах важнейшей роли ЭМП в опухолевой прогрессии, а также попытаемся объяснить связь ЭМП с приобретением клетками стволовых свойств. Мы предполагаем, что эпителиально-мезенхимальная пластичность контролируется различными вариантами основной программы ЭМП, и очень важно разобраться в этих программах и в молекулярных механизмах, лежащих в их основе. Программа эпителиально-мезенхимального перехода – естественный процесс трансдифференцировки, который обуславливает эпителиально-мезенхимальную пластичность эпителиальных клеток и способен направить развитие эпителиальных клеток в сторону мезенхимальных. Активация этой программы приводит к тому, что нормальные и опухолевые эпителиальные клетки заселяют компартменты, характерные для стволовых клеток. Программа ЭМП запускается в ответ на различные синергические сигналы микроокружения как при нормальном развитии организма, так и в процессе развития опухоли. Эпителиально-мезенхимальная пластичность критична для опухолевой прогрессии и метастазирования. Ингибирование процессов ЭМП может быть новым терапевтическим подходом к лечению рака.

ЭМП ЯВЛЯЕТСЯ ЕСТЕСТВЕННОЙ ПРОГРАММОЙ ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

В течение последнего десятилетия достигнуты огромные успехи в репрограммировании терминально дифференцированных клеток нормальных тканей в плюрипотентные стволовые клетки. Это привело к возникновению предположения, что практически всегда возможно осуществить дедифференцировку или же трансдифференцировку при условии введения необходимых эктопически экспрессированных транскрипционных факторов в зрелые клетки. Успехи в этих экспериментах по перепрограммированию клеток подняли очень важный вопрос: какие из наблюдаемых нами при этом изменений действительно являются «естественными» (встречающимися в природе), а какие «искусственными» (невозможными в природе при естественных условиях и возникающими при экспериментальном усилении эктопической экспресии генов)? Первой открытой естественной программой трансдифференцировки стала программа эпителиально-мезенхимального перехода, которая обеспечивает приобретение эпителиальными клетками некоторых мезенхимальных свойств и потерю некоторых эпителиальных. При этом существует и обратный механизм перехода – мезенхимально-эпителиальный. Данные, полученные в течение последних двух десятилетий, показали, что процессы ЭМП активируются во время нормального развития тканей и органов и обеспечивают взаимопревращения клеток разных типов, необходимые для формирования сложных тканей и органов животных. Эта клеточная биологическая программа управляется рядом транскрипционных факторов (ЭМП-ТФ), таких как факторы семейств Snail, Twist и Zeb-2. Еще два аспекта ЭМП заслуживают пристального внимания. Во-первых, в некоторых эпителиальных тканях явление ЭМП, по-видимому, связано с присутствием клеток, подобных стволовым. Во-вторых, опухолевые клетки могут видоизменять программу ЭМП, тем самым приобретая клеточные свойства, повышающие их злокачественность. Эти особенности программы ЭМП выявили ранее неизвестную связь онтогенеза и опухолевого патогенеза.

ПРОГРАММА ЭМП И ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ

ЭМП-программа, как следует из ее названия, регулирует изменения состояния клеток с более эпителиального на более мезенхимальное. В случае полного прохождения этой программы эпителиальная клетка становится мезенхимальной. Крайние степени эпителиальной и мезенхимальной дифференцировки имеют определенные отличия, приведенные в таблице 1. Так, можно отметить ключевые свойства эпителиальных клеток: полигональную форму в монослое культуры, поляризованность клеток по апикально-базальной оси и плотное соединение между соседними клетками адгезионными и плотными контактами; in vivo эти контакты обеспечивают структурную целостность слоев эпителиальных клеток. Напротив, мезенхимальные клетки имеют веретенообразную форму без признаков апикально-базальной полярности и слабо соединены с окружающим матриксом через фокальные контакты. Эти особенности мезенхимальных клеток позволяют объяснить их повышенную способность к миграции и инвазии, по сравнению с эпителиальными клетками.

*Таблица 1.* Отличия эпителиальных и мезенхимальных клеток
Свойство	Эпителиальные клетки	Мезенхимальные клетки
Морфология в 2D-культуре	Полигональные	Веретенообразные, вытянутые
Поляризованность	Апикально-базальная	Передне-задняя
Подвижность	Нет	Подвижны и инвазивны
Цитоскелет	Экспрессия цитокератинов	Экспрессия виментина
Клетка-клеточные соединения	Формируют адгезионные и плотные контакты с соседними эпителиальными клетками	Не могут формировать адгезионные и плотные контакты; связываются с окружающим внеклеточным матриксом посредством фокальных контактов

Принципиальные различия между эпителиальными и мезенхимальными клетками обусловлены различиями в соответствующих транскрипционных программах, которые контролируют, помимо прочего, экспрессию ключевых структурных белков, участвующих в поддержании цитоскелета и в образовании межклеточных контактов. Эпителиальные клетки синтезируют различные типы цитокератина, из которого построены их промежуточные филаменты, в то время как мезенхимальные клетки экспрессируют виментин, выполняющий ту же самую функцию. Экспрессия молекул межклеточной адгезии и комплексов поляризации клетки в мезенхимальных клетках, как правило, подавлена. Характерной чертой эпителиально-мезенхимального перехода является замена Е-кадгерина на N-кадгерин, что приводит к ослаблению контактов между клетками. Программа ЭМП активизируется в эпителиальных клетках с необычайно высокой скоростью в ответ на ряд физиологических сигналов, как исходящих из стромы, так и автономных. Например, при гаструляции программа ЭМП инициируется в эпителиальных клетках эпибласта, преобразуя их в мезенхимальные клетки мезодермы под воздействием ряда сигналов – факторов роста фибробластов (FGFs) и сигнального пути Wnt. Подобным образом в тканях взрослого организма программа ЭМП быстро активируется при ранениях, обеспечивая быстрое закрытие раны и восстановление эпителиальных барьеров, необходимых для защиты организма от внешних повреждающих факторов. Такое быстрое взаимопревращение эпителиальных и мезенхимальных клеток предполагает их большую чувствительность к сигналам, вызывающим ЭМП. Кроме того, эпителиальное и мезенхимальное состояния метастабильны, и для долговременного нахождения клетки в одном из них требуется работа сложных молекулярных и клеточных механизмов. Восприятие программы эпителиально-мезенхимального перехода как дискретного переключателя с двумя положениями «эпителиальная клетка» - «мезенхимальная клетка» не отражает работы этой программы, так как при ЭМП в новой «мезенхимальной клетке» остаются ключевые эпителиальные маркеры . Тем не менее, приобретение даже небольшого числа мезенхимальных свойств значительно меняет биологию клетки.

ЭМП И НОРМАЛЬНЫЕ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

Работы последних пяти лет в области ЭМП сходятся в выводах о том, что если эпителиальная клетка хотя бы частично подвергается ЭМП, то она приобретает черты эпителиальной стволовой клетки. По меньшей мере, это оказалось верным в случае клеток молочной железы, как нормальных так и опухолевых.. Учитывая биологическое подобие всех эпителиальных клеток, можно экстраполировать этот вывод и на все эпителиальные ткани. Стволовой характер эпителиальных клеток можно продемонстрировать на основании их способности воссоздавать ткань, из которой они были получены, после их трансплантации в подходящее микроокружение. Например, стволовость нормальных эпителиальных клеток молочной железы может быть оценена по их способности имплантироваться в структуру, образованную жировыми клетками молочной железы (т.е. ту структуру, из которой хирургически удалили древо млечных протоков у молодой самки мыши). После имплантации этих клеток через 6-8 недель образовались структуры «дерева» с протоками, неотличимыми от тех, которые образуются при нормальном морфогенезе молочной железы. Такой успех в формировании молочной железы дает возможность ввести строгий тест на стволовые качества, который, несомненно, подтверждает то, что подвергшиеся ЭМП эпителиальные клетки обладают свойствами стволовых клеток и могут воссоздать целый орган. В другом случае сообщалось, что в результате индукции ЭМП совместным воздействием кратко экспрессируемых ЭМП-ТФ Slug и SRY-Box9 (Sox9, SRY - область, определяющая пол в Y-хромосоме) в популяции нормальных мышиных эпителиальных клеток молочной железы количество стволовых клеток молочной железы увеличивалось в два раза. Дополнительно было показано, что ЭМП-ТФ Slug в норме экспрессируется в базальных и/или аблюминальных слоях млечных протоков мышей и человека: там же, где, как предполагается, располагаются стволовые клетки молочной железы. Анализ с методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией, проведенный на обогащенной с помощью сортинга на проточном цитометре популяции стволовых клеток молочной железы, показал, что располагающиеся в нормальных молочных протоках стволовые клетки экспрессируют транскрипционный фактор Slug (характерный для ЭМП) на уровне на два порядка выше, чем популяция дифференцированных эпителиальных клеток люминального слоя.. Эти наблюдения подтверждают, что по меньшей мере один компонент программы ЭМП может проявляться и в здоровых тканях без патологии, например, при процессах заживления или неоплазии. Найти рациональное биологическое объяснение связи между ЭМП и стволовыми качествами нелегко. Судя по всему, эта клеточная реакция является не недавним изобретением млекопитающих, а возникла еще во времена зарождения царства животных (metazoa). Шаг в сторону понимания этого процесса можно сделать, рассмотрев то, как происходит заживление ран в эпителиальных тканях. Закрытие раны включает в себя миграцию эпителиальных клеток в место дефекта, их пролиферацию и, в самом конце, сборку межклеточных соединений, таких как адгезионные контакты. Считается, что полностью эпителиальные клетки мало подвижны по сравнению с их мезенхимальными аналогами - это говорит о том, что эпителиальные клетки по краям раневого дефекта по крайней мере частично активируют программу ЭМП. Действительно, это было подтверждено на экспериментальной модели рубца в монослое кератиноцитов: по краю нанесенного разрыва эпителиальные клетки экспрессировали характерный для ЭМП транскрипционный фактор Slug. В экспериментах на мышиной модели in vivo также было показано, что в кератиноцитах, локализованных по краям кожной раны, экспрессия Slug повышена. В то же время кератиноциты, полученные от нокаутных по гену Slug мышей, оказались неспособны к закрытию раневого дефекта. Эти исследования подтверждают роль временной активации ЭМП в процессах заживления эпителиальных дефектов. В то же время этим клеткам необходимо ускорить собственную пролиферацию для быстрого закрытия дефекта. Это может потребовать присутствия стволовых клеток, которые образуются путем активации программ ЭМП. Благодаря эпителиально-мезенхимальной пластичности после миграции в область раны и быстрого увеличения популяции эпителиальные клетки, подвергшиеся ЭМП, могут пройти через МЭП для восстановления эпителиального слоя клеток и приобретения исходного эпителиального морфотипа; вероятно, обратный переход сопровождается уменьшением размеров популяции стволовых клеток. На данном этапе все это лишь неточные предположения, но рациональное объяснение вроде этого поможет обнаружить ранее незамеченную связь между ЭМП и свойствами эпителиальных стволовых клеток.

ЭМП И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

Почти 80% всех злокачественных опухолей человека происходят из эпителиальных тканей. Эти опухоли представлены разнообразными нозологическими формами: рак легких, толстой кишки, яичников, молочной железы, поджелудочной железы, предстательной железы, печени, мочевого пузыря, почки. На начальных стадиях клетки этих опухолей продолжают синтезировать цитокератины и E-кадгерин, что подтверждает их эпителиальное происхождение. Помимо этого, опухолевые клетки в ранних опухолях продолжают проявлять биологические свойства, характерные для эпителиальных клеток: они неподвижны и формируют протяженные слои клеток. Эти клетки резко отличаются от тех, которые появляются в дальнейшем в результате так называемой «опухолевой прогрессии». Клетки высокоагрессивных первичных опухолей приобретают свойства мезенхимальных клеток, что проявляется в их способности к миграции, инвазии и, как следствие, к распространению метастазированием. Эти изменения можно объяснить с той позиции, что в результате опухолевой прогрессии в данных клетках активизировались программы ЭМП. Если рассмотреть рак молочной железы как пример, то мы увидим, что приобретение клетками мезенхимальных свойств ассоциируется с более агрессивными подтипами заболевания и опухолевой прогрессией. Еще лучше связь ЭМП и опухолевой злокачественности демонстрирует ряд экспериментов по утрате или приобретению функций на ксенотрансплантатных моделях опухолей. В экспериментах на клеточных линиях опухолевых клеток молочной железы человека и животных удаление ЭМП-ТФ (Twist, Snail и Zeb1 (гомеобокс 1, связывающий E-бокс цинкового пальца)) значительно подавило метастатическое распространение как из мест первичной локализации опухоли (например, из стромальной жировой ткани молочной железы), так и после введения опухолевых клеток в венозное русло (например, в хвостовую вену). И наоборот, эктопическая активация ЭМП с помощью транскрипционных факторов приводит к усилению процессов метастазирования введенных опухолевых клеток Помимо облегчения процессов метастазирования, программа ЭМП играет важную роль в возникновении лекарственной резистентности у опухолевых клеток и рецидивов заболевания у больных раком молочной железы. Так, на мышиной модели Her2-индуцированных опухолей ЭМП-ТФ Snail способен спонтанно активироваться в очагах рецидива опухоли и направлять эти новые опухолевые клетки в сторону мезенхимального развития, что показывает еще один пример связи ЭМП и рецидива заболевания. Связь между программой ЭМП и усилением туморогенеза была продемонстрирована на разнообразных клеточных линиях человеческих опухолей. Имеются данные, что ингибирование эпителиально-мезенхимального перехода с помощью блокирования ЭМП-ТФ Zeb1 подавляет переход опухолевых клеток из состояния низкой онкогенности к более высокой. Интересно, что ряд недавних исследований показал наличие связи между программой ЭМП и приобретением некоторыми опухолями способности подавлять иммунный ответ. В случае меланомы экспрессия ЭМП-ТФ Snail одновременно ингибирует дифференцировку цитотоксических Т-лимфоцитов и индуцирует образование иммуносупрессивных регуляторных Т-лимфоцитов, причем второй эффект опосредован продукцией тромбоспондина. При раке молочной железы активация программы ЭМП в опухолевых клетках приводит к увеличению их резистентности к лизису цитотоксическими Т-лимфоцитами, что частично связано с индукцией аутофагии. В клетках рака легкого активация Zeb1 связана с экспрессией лиганда программируемой гибели-1 (Programmed death-ligand 1 - PD-L1) – иммуносупрессивной молекулы, блокирующей деятельность инфильтрирующих опухоль лимфоцитов. Учитывая множественные эффекты активации программы ЭМП на развитие рака и растущее количество данных об ассоциации ЭМП с разными типами агрессивных раковых клеток, можно резонно предположить, что фактически все раковые опухоли начинают проявлять злокачественность в результате активации ЭМП в опухолевых клетках. Однако данное утверждение может и должно быть рассмотрено критически, так как многие клинические патоморфологи оспаривают само существование программы ЭМП или ее роль в формировании низкодифференцированной карциномы. Значительная часть их недовольства, видимо, происходит из-за технической стороны вопроса. С помощью используемых маркеров очень сложно (а иногда и невозможно) отличить на препарате ткани подвергшиеся ЭМП опухолевые клетки от прилежащих к ним клеток опухолевой стромы: рекрутированных из нормальных тканей фибробластов и миофибробластов, которые в норме экспрессируют маркеры ЭМП. В виду того, что клетки карциномы часто зачастую подвергаются частичному ЭМП, достоверным доказательством участия этой программы в развитии опухоли может служить обнаружение клеток, которые экспрессируют приобретенные мезенхимальные черты одновременно с определенными “остаточными” эпителиальными маркерами, унаследованными от своих полностью эпителиальных предшественников. Действительно, недавние исследования образцов рака молочной железы человека методом гибридизации in situ одновременно на эпителиальные и мезенхимальные маркеры позволили обнаружить клетки опухоли, обладающие как эпителиальными, так и мезенхимальными маркерами при инвазивном раке молочной железы любого подтипа. Кроме того, значительная часть циркулирующих опухолевых клеток, выделенных из периферической крови больных раком молочной железы или раком простаты, также экспрессировали и мезенхимальные и эпителиальные маркеры. Широкое участие программы ЭМП в патогенезе карцином поднимает вопрос о ее возможной роли в развитии некарциноматозных опухолей, встречающихся в клинике. Нейроэктодермальные опухоли, такие как глиомы и глиобластомы, часто имеют мезенхимальные маркеры на своих клетках, включая различные транскрипционные факторы ЭМП, что может свидетельствовать о частичном прохождении ими ЭМП. С точки зрения биологии развития, данное обстоятельство можно объяснить тем, что источником развития этих опухолей является нейроэктодерма - примитивный эпителий. Однако прогрессирование двух других крупных классов опухолей (гемобластозов и мезенхимальных опухолей), по-видимому, не связано с активацией программы ЭМП. Действительно, по меньшей мере в случае сарком клетки (вероятно, клетки похожие на фибробласты и мезенхимальные стволовые клетки (МСК)) постоянно продуцируют ряд транскрипционных факторов ЭМП, по видимому, для поддержания своего мезенхимального состояния. Можно предположить, что нормальные клетки, давшие начало саркоме, прошли через программу ЭМП на ранних стадиях онтогенеза, задолго до развития опухоли. Действительно, примитивные клетки соединительной ткани (т.е. клетки, похожие на МСК) могут быть созданы экспериментально при инициации полного прохождения эпителиальными клетками программы ЭМП. При этом полностью исчезают признаки эпителиального происхождения, которые замещаются на мехенхимальные признаки.

ЭМП И ПЕРЕХОД В СОСТОЯНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Имеется множество сообщений о наблюдениях клеточной неоднородности в различных гемобластозах и солидных опухолях. Одной характерной чертой данной неоднородности является наличие опухолевых клеток с различной способностью инициировать дальнейший рост неоплазии. Клетки с повышенным туморогенным потенциалом были названы «опухоле-инициирующими клетками», «опухолевыми стволовыми клетками» или ОСК, так как их свойства напоминают таковые у естественных стволовых клеток: они могут поддерживать свою популяцию и порождать более дифференцированных потомков. Наличие ОСК можно подтвердить в эксперименте по трансплантации опухолевых клеток в ограниченных разведениях чувствительной к ним мыши. Впоследствии производится оценка наличия опухолей. Этим методом было подтверждено, что инициация ЭМП в клетках опухоли молочной железы человека с помощью кратковременной экспрессии ЭМП-ТФ может привести к увеличению количества ОСК. Эти данные свидетельствуют о том, что программы ЭМП могут играть определенную роль в превращении нестволовых клеток в стволовые как в нормальной ткани молочной железы, так и при развитии в ней опухоли. Важно отметить, что в приведенных исследованиях (практически все они были связаны с искусственной активацией ЭМП-ТФ) не принимался во внимание тот факт, что эти факторы могут активироваться и в естественных условиях, при этом взаимодействуя между собой и обеспечивая процессы ЭМП при различных физиологических состояниях. При экспериментальной индукции ЭМП разработанными на данный момент методиками временная экспозиция и уровни экспрессируемых ЭМП-ТФ значительно отличаются от наблюдаемых в физиологических условиях. Соответственно, популяция ОСК могла бы увеличиться значительно сильнее после активации ЭМП, если бы эти эксперименты проводились в подходящих физиологических условиях. Учитывая многочисленные последовательные шаги, происходящие во время опухолевой прогрессии, которые ведут к изменениям от нормальной клетки до очень злокачественной, можно резонно предположить, что каждая существующая на определенной стадии канцерогенеза (гиперпластической, диспластичекой, аденоматозной и т.д.) популяция клеток содержит свою собственную субпопуляцию стволовых клеток. Свойства этих субпопуляций предположительно должны зависеть от активации определенных вариантов программы стволовых клеток, действующей в нормальных или опухолевых популяциях в зависимости от специфики ткани. Для того, чтобы обеспечить доминирующие на определенной стадии клетки идеальной комбинацией эпителиальных и мезенхимальных свойств и поддержать их в пластичном состоянии, в осуществлении разных вариантов клеточной стволовой программы могут потенциально участвовать различные комбинации ЭМП-ТФ с возможностью поддержания определенного уровня выраженности эпителиально-мезенхимального перехода. Судя по всему, сохранение пластичности очень важно, так как ряд исследований показал, что принудительная экспрессия генов сильных индукторов ЭМП – Twist и фактора Prrx1 (Paired Related Homeobox 1) – нарушает пластичность и блокирует обратный процесс - МЭП, который определяет способность раковых клеток к туморогенезу и образованию метастатических очагов. И наоборот, временная активация ЭМП в нормальных и опухолевых клетках рака молочной железы позволяет им приобрести качества стволовых за счет усиления их эпителиально-мезенхимальной пластичности. Исходя из всего вышесказанного, ОСК (как и нормальные стволовые клетки) имеют промежуточный эпителиально-мезенхимальный фенотип, что позволяет им дифференцироваться как в эпителиальные, так и в мезенхимальные клетки. Если это будет подтверждено, то окажется, что стволовые клетки отличаются от настоящих мезенхимальных клеток, которые полностью дифференцированы в мезенхимальном направлении.

КОНТЕКСТНЫЕ СИГНАЛЫ ИНДУКЦИИ ЭМП В КЛЕТКАХ КАРЦИНОМЫ

Схемы активации ЭМП во время естественного развития показывают, что эта программа должна включаться в ответ на контекстные сигналы (условия среды и сигналы, исходящие от микроокружения), с которыми сталкиваются отдельные клетки различной локализации при развитии эмбриона. Можно также предположить, что в процессах заживления ран и опухолевой прогрессии для активации программы ЭМП тоже используются соответствующие наборы гетеротипических сигналов. В некоторых карциномах можно наблюдать включение программы ЭМП в тех клетках, которые тесно связаны с клетками стромы и формируют «реактивную строму», появляющуюся на поздних стадиях опухолевой прогрессии. В состав поздней стромы входят не только доминирующие в ней фибробласты и миофибробласты, но также и клетки, связанные с заживлением ран и воспалением – мезенхимальные стволовые клетки, макрофаги и лимфоциты. После активации длительное выполнение программы ЭМП в клетках карциномы может зависеть от непрерывных паракринных сигналов, исходящих от клеток стромы. Из этого можно сделать вывод, что опухолевые клетки вернутся обратно в эпителиальное состояние через МЭП при прекращении получения сигналов. Возможен и противоположный вариант: клетки карциномы, которые находятся в состоянии ЭМП, могут поддерживать это состояние путем автономной, независимой от стромы стимуляции с помощью петель положительной обратной связи. Среди этих гетеротипических паракринных сигналов хорошо изучен трансформирующий фактор роста β (TGF-β): цитокин, который преимущественно вырабатывается миофибробластами. Кроме того, имеются данные о других молекулах, способных участвовать в запуске ЭМП: морфогенах Wnt, Notch, Sonic hedgehog (Shh), цитокинах, простагландине Е2 и факторах роста, таких как эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фиобробластов (FGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) . Во многих ситуациях программы ЭМП активируются в ответ на комбинацию нескольких различных паракринных сигналов, чтобы обеспечить избирательную индукцию ЭМП только в тех клетках, которые отвечают определенным требованиям. В рамках нормального развития такой подход обеспечивает активацию ЭМП только в определенных секторах эмбриона. В случае опухолевой прогрессии ЭМП индуцируется и поддерживается совокупностью внешних сигналов из опухолевого микроокружения. (см. схема 1). Действительно, ПГЕ2 может секретироваться фибробластами, миофибробластами и МСК, а лиганд хемокина C-C 18 (CCL18) и эфрин синтезируются макрофагами и моноцитами; TGF-β секретируется миофибробластами и тромбоцитами. На различных экспериментальных моделях было показано, что подавление одного из этих сигналов может привести к ингибированию активации ЭМП и значительно ослабить инициацию опухолевого роста и метастазирование при ксенотрансплантации опухолей. Это подтверждает тезис о том, что ЭМП является сложным многокомпонентным процессом, требующим для своей работы большое количество различных контекстных сигналов.

Источник: журнал Cell Во время опухолевой прогрессии ЭМП индуцируется и поддерживается с помощью комбинации сигналов, действующих как паракринно, так и юкстакринно. Сокращения: MSC – мезенхимальные стволовые клетки. Разнообразные ЭМП-индуцирующие сигналы, перечисленные выше, активируют экспрессию ЭМП-ТФ, таких как белки семейств Snail, Twist, Zeb, FOX и других. Такое разнообразие путей активации программы ЭМП позволяет предположить, что, возможно, существуют ее различные варианты для морфогенеза определенных тканей и развития определенных типов опухолей. Более того, для регуляции ЭМП существуют несколько посттранскрипционных и эпигенетических механизмов контроля. Например, транскрипционные факторы из семейства Zeb имеют механизм двойной отрицательной обратной связи с семейством микроРНК-200, в результате чего достигается дискретная корректировка положения переключателя «эпителильная/мезенхимальная клетка» в некоторых карциномах. Snail способен подавлять экспрессию микроРНК-34, которая в противном случае может связываться с 3’- нетранслируемой областью мРНК Snail и разрушать его. Программа ЭМП также приводит к глубоким изменениям в транскриптоме клетки путем изменения экспрессии транскрипционных факторов, таких как эпителиальные белки, регулирующие сплайсинг (ESRP), RBFOX, Muscleblind-like (MBNL), CUG-BP- и ETR-3-подобные факторы (CELF) и семейство гетерогенных ядерных нуклеопротеинов (hnRNP), обуславливая производство мРНК, характерных для мезенхимальных клеток. Помимо количества микроРНК, программа ЭМП может менять конфигурацию хроматина, вызывая тем самым длительное устойчивое «молчание» эпителиальных генов в клетках, подвергшихся полному ЭМП. К примеру, Snail способен вызывать накопление и активацию ферментов, модифицирующих хроматин, что приводит к изменению промотора гена Е-кадгерина посредством удаления ключевой метки активной транскрипции (триметилированного H3K4) и замене ее на триметилированный H3K9. Такое изменение приводит к накоплению ДНК-метилтрансфераз, которые, в свою очередь, способствуют метилированию промотора по сайтам CpG и таким образом формируют устойчивый к активации транскрипции конститутивный гетерохроматин. Помимо этих режимов регулирования совсем недавно было показано, что метаболическое перепрограммирование может служить еще одним механизмом самоподдержания программы ЭМП. В частности, индукция ЭМП в клетках опухоли молочной железы человека привела к экспрессии пиримидин-разлагающего фермента дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD), который приводит к накоплению в мезенхимальных клетках дигидропиримидинов. Эти метаболические изменения требуются для активации и поддержания экспрессии программы ЭМП, так как shRNA-опосредованное молчание DPYD или уменьшение внутриклеточной концентрации дигидропиримидинов приводят к ослаблению мезенхимальных свойств, в том числе и способности клеток к инвазии и метастазированию.

ЭМП, ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ И КАСКАД ИНВАЗИИ-МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ

Поздние стадии прогрессии карцином можно описать как последовательность этапов, именуемую «каскадом инвазии-метастазирования». При этом клетки карциномы в первичных опухолях приобретают способность к инвазии, интравазируют в микроциркуляторные сосуды опухоли, с током крови переносятся к отдаленным частям тела (гематогенная диссеминация), прикрепляются к стенке микроциркуляторных сосудов в этих отдаленных тканях, проникают через стенку микрососудов в паренхиму этих тканей (экстравазация), дают начало микрометастазам и, в ряде случаев, макроскопическим, клинически выраженным метастазам. Этот последний шаг, называемый «колонизация», обычно характеризуется низкой эффективностью. В одной из разновидностей этого каскада лимфатические узлы, дренирующие участки формирования первичной опухоли, выступают в качестве временных хранилищ для опухолевых клеток, которые накапливаются здесь благодаря дренирующим лимфатическим протокам опухоли, тут же и пролиферируют и затем гематогенным путём диссеминируют к отдалённым тканям. В то время как серьезный вклад множества генетических и наследственных эпигенетических нарушений в образование первичной опухоли уже достаточно хорошо изучен, влияние этих изменений на завершение многочисленных этапов каскада инвазии-метастазирования остаётся неясным. Возможно, мутации, ответственные за развитие первичной опухоли, не способствуют прохождению раковыми клетками этапов каскада; зато появляются дополнительные мутантные аллели, повзоляющие клеткам метастатически диссеменировать. Возможен противоположный вариант: генетические (и наследуемые эпигенетические) повреждения, которые несут в себе первичные опухолевые клетки, могут оказаться достаточными факторами для активации в этих клетках программы диссеминации; в соответствии с этим вторым сценарием, некоторые изменения в эпигенетической программе могут самостоятельно стимулировать клетки первичной карциномы к распространению в отдалённые участки. Если подтвердится второе предположение, это будет значить, что раковые клетки в составе первичной опухоли уже имеют генетические изменения, позволяющие им диссеменировать, и не нуждаются в дополнительных мутациях помимо тех, что уже были отобраны в ходе первичного туморогенеза. В свете последних полученных данных это предположение представляется вполне вероятным. Индукция экспрессии ЭМП-ТФ в неметастазирующей первичной опухоли приводит к повышению способности ее клеток к метастазированию в легкие без внесения дополнительных генетических изменений. Есть и косвенные доказательства этого предположения: время, необходимое для трансформации аденоматозных полипов прямой кишки в карциномы, равняется в приблизительно 17 годам, однако уже в течение двух или менее лет после этого обнаруживаются метастазы этих карцином в печени . На основании этого можно сделать вывод, что для трансформации полипа в карциному необходимы достаточно «редкие» мутации, что объясняет такую долгую задержку трансформации, в то время как необходимые для метастатического поражения печени эпигенетические изменения происходят гораздо быстрее. Тем не менее, ни одно из этих доказательств (доклиническое или клиническое) не способно достоверно подтвердить, что именно эпигенетическая активация ранее неактивной программы транскрипции, в том числе ЭМП, привела к распространению опухолевых клеток в отдаленные сайты. Последний шаг каскада инвазии-метастазирования колонизация, по-видимому, не попадает в компетенцию программы ЭМП. Таким образом, превращение микрометастаза в макрометастаз помимо прочего требует адаптации клеток, возникших в одной полностью дифференцированной ткани, к чужеродному и потенциально “негостеприимному” микроокружению другой, иначе дифференцированной ткани. Например, как клетки рака груди, которые возникают и развиваются в микроокружении, свойственном молочной железе, могут быть адаптированы к выживанию и размножению в совершенно других тканях – в печени, головном мозге, легких или костном мозге? В уже изученные функции ЭМП, по-видимому, не входит приобретение клетками таких адаптивных возможностей, и предполагается, что эти клетки должны приобрести данные способности самостоятельно после своего прибытия в удаленное от очага первичной опухоли место. Действительно, вполне возможно, что такая программа у распространяющихся клеток каждого пациента уникальна и собирается из множества компонентов различных программ дифференцировки. Поэтому программа адаптации клеток к микросреде костного мозга у одной больной с раком молочной железы может отличаться от адаптационной программы у другой больной с идентичным диагнозом. Тот факт, что такую адаптацию сложно приобрести, сочетается с наблюдаемой низкой вероятностью успешной колонизации Хотя до сих пор непонятно, по каким механизмам приобретаются данные адаптивные способности (по генетическим или эпигенетическим), накапливаются свидетельства о том, что для успешной метастатической колонизации необходима программа МЭП. Действительно, отдаленные метастазы, встречающиеся у пациентов с карциномами, чаще всего представлены клетками, проявляющими эпителиальные свойства и даже расположенными характерным для эпителия образом. Следовательно, псевдо-мезенхимальные клетки, служащие основателями отдаленных метастатических колоний, должны обладать способностью к созданию большого числа эпителиальных потомков и организации взаимодействия опухолевых стволовых клеток с другими по аналогии с соответствующей первичной опухолью. Кроме того, согласно сообщениям о нескольких исследованиях, проведенных на разных моделях опухолей и клеточных линиях, чрезмерная активация ЭМП блокирует МЭП и тем самым предотвращает метастатическую колонизацию. Эти наблюдения показывают, что эпителиально-мезенхимальная пластичность лежит в основе развития опухоли и может использоваться опухолевыми клетками для успешного завершения последнего шага – колонизации отдаленных тканей. Это напоминает динамические взаимопревращения эпителиальных и мезенхимальных клеток в эмбриогенезе, где ЭМП и последующий за ним МЭП необходимы для развития эпителиальных структур из мезодермы, таких как собирательные трубочки почек (из промежуточной мезодермы) и мезотелиальных мембран (из латеральной пластинки мезодермы).

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Обнаруженная связь между активацией программы ЭМП и приобретением опухолевыми клетками стволовости позволяет сделать вывод о том, что программа ЭМП – ключевой регулятор прогрессии карциномы. Таким образом, помимо традиционного представления об ЭМП как о важном факторе, необходимом для успешного метастазирования, мы должны также взглянуть на программу ЭМП как на прямой фактор инициации опухолевого роста, приводящий к появлению ОСК, способных к метастазированию. Кроме того, эпителиально-мезенхимальная пластичность позволяет клеткам опухоли переключаться между состоянием мезенхимальной ОСК и состоянием более дифференцированной, способной к быстрой пролиферации эпителиальной клетки, что обуславливает гетерогенность опухолевой популяции. Эпителиально-мезенхимальная пластичность подразумевает способность клетки находиться в промежуточном мезенхимальном состоянии, проявляя различные комбинации эпителиальных и мезенхимальных свойств. Кроме того, в различных типах карцином ОСК обладают повышенной резистентностью к различным лечебным процедурам, включая химио- и радиотерапию. Устойчивость приводит к увеличению доли ОСК после лечения и зачастую приводит к клиническому рецидиву заболевания. Эти наблюдения объясняют, почему ЭМП и приобретение клетками стволовости все больше и больше привлекают к себе внимание в процессе поиска новых способов лечения прогрессировавших карцином, в большинстве которых рано или поздно появляется поколение клеток, резистентных к терапии, что приводит к летальному исходу. Эти метастабильные, отчасти мезенхимальные состояния, возникающие в различных карциномах, скорее всего контролируются множеством вариантов программы ЭМП, которые отличаются друг от друга комбинациями используемых ЭМП-ТФ, эпигенетическими и метаболическими профилями, а также ауто- и паракринными сигналами, запускающими и поддерживающими их. Мы полагаем, что будущие исследования определят новые маркеры, которые позволят классифицировать различные промежуточные состояния ЭМП и объяснят, как инициируется и запускается опухолевый рост в различных опухолях и на различных стадиях развития опухоли (подробнее смотреть Главные вопросы). Эти результаты помогут нам разработать более эффективные способы ранней диагностики и лечения злокачественных солидных опухолей.

ГЛАВНЫЕ ВОПРОСЫ

Какие имеются функционально важные отдельные промежуточные клеточные состояния между эпителиальной и мезенхимальной клеткой, возникающие ествественным путем в физиологических и патологических условиях, а особенно в прогрессии карцином?
Какие свойства и/или маркеры помогут идентифицировать эти состояния?
Какие из этих состояний способствуют образованию эпителиальных стволовых клеток?
Какие комбинации транскрипционных факторов ЭМП влияют на данные состояния?
Какие типы контекстных сигналов, действуя в различных комбинациях, приводят к физиологической активации экспрессии ЭМП-ТФ и переходу клеток в более мезенхимальные состояния?
Являются ли подробно описанные для эпителия молочной железы тесные функциональные связи между стволовыми клетками и программой ЭМП общими для всех эпителиальных тканей, или же связь между ЭМП и стволовостью в других опухолях регулируется на основании иных принципов?
Имеются ли еще необнаруженные биологические программы, которые совместно с ЭМП управляют процессом перехода клеток в стволовое состояние и обратно?
Происходит ли активная индукция МЭП специфическими сигналами, или же это процесс, протекающий по умолчанию в случае отсутствия ЭМП-индуцирующих сигналов? Почему эпителиально-мезенхимальная пластичность так важна для поддержания нормальных и опухолевых клеток в стволовом состоянии?
Как можно реверсировать программу ЭМП в целях ликвидации резистентных к терапии опухолевых стволовых клеток?

Оригинал статьи Перевод: Азат Муртазин, Антон Яценко, Муза Гумилева, Полина Тиканова Изображение: Test Page Редакция: Deepest Depths, Test Page, Азат Муртазин, Даня Ряскина, Зенфира Махмудова, Михаил Гусев, Муза Гумилева, Полина Тиканова ССЫЛКИ

Takahashi, K. and Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult ﬁbroblast cultures by deﬁned factors. Cell 126, 663–676
Yu, J. et al. (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917–1920
Nieto, M.A. (2013) Epithelial plasticity: a common theme in embryonic and cancer cells. Science 342, 1234850
Thiery, J.P. et al. (2009) Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell 139, 871–890
Nieto, M.A. (2011) The ins and outs of the epithelial to mesenchymal transition in health and disease. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 347–376
Tam, P.P. and Behringer, R.R. (1997) Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mech. Dev. 68, 3–25
Savagner, P. et al. (2005) Developmental transcription factor slug is required for effective re-epithelialization by adult keratinocytes. J. Cell Physiol. 202, 858–866
Grunert, S. et al. (2003) Diverse cellular and molecular mechanisms contribute to epithelial plasticity and metastasis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 657–665
Theveneau, E. et al. (2010) Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell 19, 39–53
Guo, W. et al. (2012) Slug and Sox9 cooperatively determine the mammary stem cell state. Cell 148, 1015–1028
Mani, S.A. et al. (2008) The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell 133, 704–715
Morel, A.P. et al. (2012) EMT inducers catalyze malignant transformation of mammary epithelial cells and drive tumorigenesis towards claudin-low tumors in transgenic mice. PLoS Genet. 8, e1002723
Morel, A.P. et al. (2008) Generation of breast cancer stem cells through epithelial–mesenchymal transition. PLoS ONE 3, e2888
Scheel, C. et al. (2011) Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast. Cell 145, 926–940
Blanpain, C. et al. (2007) Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell 128, 445–458
Shackleton, M. et al. (2006) Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature 439, 84–88
Stingl, J. et al. (2006) Puriﬁcation and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature 439, 993–997
Nassour, M. et al. (2012) Slug controls stem/progenitor cell growth dynamics during mammary gland morphogenesis. PLoS ONE 7, e53498
Shirley, S.H. et al. (2010) EMT, cancer stem cells and drug resistance: an emerging axis of evil in the war on cancer. Oncogene 29, 4741–4751
Huber, M.A. et al. (2005) Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transition during tumor progression. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 548–558
Rhim, A.D. et al. (2012) EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell 148, 349–361
Sarrio, D. et al. (2008) Epithelial-mesenchymal transition in breast cancer relates to the basal-like phenotype. Cancer Res. 68, 989–997
Aleskandarany, M.A. et al. (2014) Epithelial mesenchymal transition in early invasive breast cancer: an immunohistochemical and reverse phase protein array study. Breast Cancer Res. Treat. 145, 339–348
Blanco, M.J. et al. (2002) Correlation of Snail expression with histological grade and lymph node status in breast carcinomas. Oncogene 21, 3241–3246
Blick, T. et al. (2008) Epithelial mesenchymal transition traits in human breast cancer cell lines. Clin. Exp. Metastasis 25, 629–642
Choi, Y. et al. (2013) Epithelial-mesenchymal transition increases during the progression of in situ to invasive basal-like breast cancer. Hum. Pathol. 44, 2581–2589
Roy, S.S. et al. (2014) Signiﬁcance of PELP1/HDAC2/miR-200 regulatory network in EMT and metastasis of breast cancer. Oncogene 33, 3707–3716
Wu, Y. et al. (2009) Stabilization of snail by NF-kappaB is required for inﬂammation-induced cell migration and invasion. Cancer Cell 15, 416–428
Yang, J. et al. (2004) Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell 117, 927–939
Zhang, K. et al. (2013) The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nat. Cell Biol. 15, 677–687
Tran, H.D. et al. (2014) Transient SNAIL1 expression is necessary for metastatic competence in breast cancer. Cancer Res. 74, 6330–6340
Cheng, Q. et al. (2014) A signature of epithelial–mesenchymal plasticity and stromal activation in primary tumor modulates late recurrence in breast cancer independent of disease subtype. Breast Cancer Res. 16, 407
Creighton, C.J. et al. (2009) Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13820–13825
Oliveras-Ferraros, C. et al. (2012) Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) confers primary resistance to trastuzumab (Herceptin). Cell Cycle 11, 4020–4032
Moody, S.E. et al. (2005) The transcriptional repressor Snail promotes mammary tumor recurrence. Cancer Cell 8, 197–209
Creighton, C.J. et al. (2010) Epithelial-mesenchymal transition (EMT) in tumor-initiating cells and its clinical implications in breast cancer. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 15, 253–260
Chaffer, C.L. et al. (2013) Poised chromatin at the ZEB1 promoter enables breast cancer cell plasticity and enhances tumorigenicity. Cell 154, 61–74
Kudo-Saito, C. et al. (2009) Cancer metastasis is accelerated through immunosuppression during Snail-induced EMT of cancer cells. Cancer Cell 15, 195–206
Akalay, I. et al. (2013) Epithelial-to-mesenchymal transition and autophagy induction in breast carcinoma promote escape from T-cell-mediated lysis. Cancer Res. 73, 2418–2427
Akalay, I. et al. (2015) Targeting WNT1-inducible signaling pathway protein 2 alters human breast cancer cell susceptibility to speciﬁc lysis through regulation of KLF-4 and miR-7 expression. Oncogene 34, 2261–2271
Chen, L. et al. (2014) Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat. Commun. 5, 5241
Tarin, D. et al. (2005) The fallacy of epithelial mesenchymal transition in neoplasia. Cancer Res. 65, 5996–6000 discussion 6000–5991
Yu, M. et al. (2013) Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science 339, 580–584
Husemann, Y. et al. (2008) Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell 13, 58–68
Raimondi, C. et al. (2011) Epithelial-mesenchymal transition and stemness features in circulating tumor cells from breast cancer patients. Breast Cancer Res. Treat. 130, 449–455
Kahlert, U.D. et al. (2013) Epithelial-to-mesenchymal(-like) transition as a relevant molecular event in malignant gliomas. Cancer Lett. 331, 131–138
Tso, C.L. et al. (2006) Primary glioblastomas express mesenchymal stem-like properties. Mol. Cancer Res. 4, 607–619
Chang, H.Y. et al. (2002) Diversity, topographic differentiation, and positional memory in human ﬁbroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12877–12882
Battula, V.L. et al. (2010) Epithelial-mesenchymal transition-derived cells exhibit multilineage differentiation potential similar to mesenchymal stem cells. Stem Cells 28, 1435–1445
Ocana, O.H. et al. (2012) Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer Cell 22, 709–724
Stankic, M. et al. (2013) TGF-beta-Id1 signaling opposes Twist1 and promotes metastatic colonization via a mesenchymal-to-epithelial transition. Cell Rep. 5, 1228–1242
Tsai, J.H. et al. (2012) Spatiotemporal regulation of epithelial-mesenchymal transition is essential for squamous cell carcinoma metastasis. Cancer Cell 22, 725–736
Schmidt, J.M. et al. (2015) Stem-cell-like properties and epithelial plasticity arise as stable traits after transient Twist1 activation. Cell Rep. 10, 131–139
Oft, M. et al. (1998) TGFbeta signaling is necessary for carcinoma cell invasiveness and metastasis. Curr. Biol. 8, 1243–1252
Li, H.J. et al. (2012) Cancer-stimulated mesenchymal stem cells create a carcinoma stem cell niche via prostaglandin E2 signaling. Cancer Discov. 2, 840–855
Lu, H. et al. (2014) A breast cancer stem cell niche supported by juxtacrine signalling from monocytes and macrophages. Nat. Cell Biol. 16, 1105–1117
Su, S. et al. (2014) A positive feedback loop between mesenchymal-like cancer cells and macrophages is essential to breast cancer metastasis. Cancer Cell 25, 605–620
Labelle, M. et al. (2011) Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell 20, 576–590
Brabletz, S. and Brabletz, T. (2010) The ZEB/miR-200 feedback loop–a motor of cellular plasticity in development and cancer? EMBO Rep. 11, 670–677
Burk, U. et al. (2008) A reciprocal repression between ZEB1 and members of the miR-200 family promotes EMT and invasion in cancer cells. EMBO Rep. 9, 582–589
Hill, L. et al. (2013) ZEB/miR-200 feedback loop: at the crossroads

of signal transduction in cancer. Int. J. Cancer 132, 745–754

Brabletz, T. (2012) MiR-34 and SNAIL: another double-negative feedback loop controlling cellular plasticity/EMT governed by p53. Cell Cycle 11, 215–216
Kim, N.H. et al. (2011) A p53/miRNA-34 axis regulates Snail1-dependent cancer cell epithelial-mesenchymal transition. J. Cell Biol. 195, 417–433
Shapiro, I.M. et al. (2011) An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218
Tam, W.L. and Weinberg, R.A. (2013) The epigenetics of epithelial- mesenchymal plasticity in cancer. Nat. Med. 19, 1438–1449
Lin, Y. et al. (2014) Epigenetic regulation of EMT: the Snail story. Curr. Pharm. Des. 20, 1698–1705
Shaul, Y.D. et al. (2014) Dihydropyrimidine accumulation is required for the epithelial-mesenchymal transition. Cell 158, 1094–1109
Fidler, I.J. (1978) Tumor heterogeneity and the biology of cancer invasion and metastasis. Cancer Res. 38, 2651–2660
Fidler, I.J. (2003) The pathogenesis of cancer metastasis: the seed and soil’ hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer 3, 453–458
Calabrese, P. et al. (2004) Pretumor progression: clonal evolution of human stem cell populations. Am. J. Pathol. 164, 1337–1346
Jones, S. et al. (2008) Comparative lesion sequencing provides insights into tumor evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4283–4288
Klein, C.A. (2009) Parallel progression of primary tumours and metastases. Nat. Rev. Cancer 9, 302–312
Cameron, M.D. et al. (2000) Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of meta- static inefﬁciency. Cancer Res. 60, 2541–2546
Chambers, A.F. et al. (2002) Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer 2, 563–572
Luzzi, K.J. et al. (1998) Multistep nature of metastatic inefﬁciency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am. J. Pathol. 153, 865–873
Malanchi, I. et al. (2012) Interactions between cancer stem cells and their niche govern metastatic colonization. Nature 481, 85–89
Thiery, J.P. (2002) Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nat. Rev. Cancer 2, 442–454
Chaffer, C.L. et al. (2011) Normal and neoplastic nonstem cells can spontaneously convert to a stem-like state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7950–7955
Gupta, P.B. et al. (2011) Stochastic state transitions give rise to phenotypic equilibrium in populations of cancer cells. Cell 146, 633–644
Singh, A. and Settleman, J. (2010) EMT, cancer stem cells and drug resistance: an emerging axis of evil in the war on cancer. Oncogene 29, 4741–4751
Gupta, P.B. et al. (2009) Identiﬁcation of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell 138, 645–659
Caramel, J. et al. (2013) A switch in the expression of embryonic EMT-inducers drives the development of malignant melanoma. Cancer Cell 24, 466–480