Новый метод редактирования генома приближает к излечению фенилкетонурии
Автор: Koyaanis Katsi
Редакция: Михаил Повиленский
Оформление: Cornu Ammonis


Многие родители знают о существовании такого заболевания, как фенилкетонурия: в России проводится скрининг новорожденных на наследственные заболевания, в число которых входит и данное нарушение обмена веществ. При выявлении фенилкетонурии младенцу назначают специальную диету, чтобы избежать накопления в организме аминокислоты фенилаланина. Избыток этого вещества приводит к задержке умственного и физического развития, поэтому если больных фенилкетонурией детей не лечить, у них развивается умственная отсталость.

Причиной фенилкетонурии является мутация в гене фермента фенилаланингидроксилазы (Pah). Этот фермент вырабатывается клетками печени и отвечает за метаболизм фенилаланина. Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу, то есть возникает у ребёнка в том случае, если он унаследовал один повреждённый ген от матери и один — от отца. На данный момент не существует ни одного метода полного излечения фенилкетонурии.



Улучшение системы CRISPR/Cas9

Команда исследователей под руководством профессора Геральда Шванка смогла не просто откорректировать мутации гена PAH в клетках печени, но и добиться тем самым излечения от фенилкетонурии, по крайней мере, у мышей.

С помощью системы CRISPR/Cas9, дополненной одним ферментом исследователи изменили последовательность нуклеотидов ДНК в соответствующем гене у взрослых мышей. В итоге мышей удалось вылечить — клетки их печени смогли вырабатывать функционирующий фермент Pah.

Рассмотрим эксперимент подробнее: система CRISPR/Cas9, дополненная ферментом цитидин-дезаминазой, связывается с локусом гена, который необходимо исправить, и точечно расплетает двойную цепь ДНК. Дезаминаза превращает пару мутантных нуклеотидов C-G в T-A, которые должны находиться в этом месте в норме. Тем самым исправляется ошибка в последовательности ДНК, кодирующей фермент Pah.

При использовании традиционного метода CRISPR/Cas центральным элементом редактирования генома выступает индуцирование двухцепочечного разрыва ДНК. Двойная цепь разрезается в определенной точке, и клетка пытается «склеить» разрез с использованием различных механизмов. Если в клетку ввести подходящую последовательность ДНК, она встроится в участок разрыва и позволит специализированному механизму восстановления точно модифицировать конкретную генетическую последовательность.

Основная проблема этого метода заключается в том, что большинство клеток человека преимущественно используют другие механизмы восстановления ДНК, которые нередко приводят к дополнительным нежелательным мутациям.



Более мягкое редактирование генома

Исследователи убедились, что новый инструмент для редактирования генома намного эффективнее традиционного метода CRISPR/Cas9: исправить удалось около 60 % всех мутантных копий гена в печени мышей. Это привело к тому, что концентрация фенилаланина упала до нормального уровня, и у животных больше не наблюдалось никаких признаков заболевания.

Чтобы доставить новый инструмент редактирования генома в клетки печени, исследователи внедряли необходимые гены в аденоассоциированный вирус и вводили частицы в кровь мышей. Вирус проникал в клетки печени и внедрял в их геном необходимые для синтеза редактирующих ферментов гены.



Излечение других метаболических заболеваний

«Этот подход обладает большим потенциалом для терапевтического применения», — говорит Геральд Шванк. Однако это исследование является лишь начальным этапом, и за ним должны последовать эксперименты на других животных. Только после проверки эффективности и безопасности нового инструмента для редактирования генома можно рассматривать его применение для лечения заболеваний человека.

Предыдущие методы редактирования генома оказались малоэффективными для коррекции мутаций даже на этапе исследований на животных. По словам Шванка, уровень коррекции в печени взрослых мышей достигал всего нескольких процентов. Здесь же учёные добились многократно более успешного редактирования — до такого уровня никто ранее не доходил.

Шванк считает, что риски побочных явлений такой терапии будут низкими. После применения инструмента редактирования в модели на мышах исследователи не обнаружили «нецелевых» мутаций (за пределами редактируемого участка). Шванк хотел бы более внимательно рассмотреть этот момент в дальнейших исследованиях. «Печень человека состоит из нескольких миллиардов клеток. Нам бы не хотелось, чтобы даже в одной из них возникла мутация, способная вызвать рак», — подчеркивает Шванк. Также необходимо выяснить, не приводит ли к каким-либо неблагоприятным последствиям внедрение в печень аденоассоциированного вируса, который используется исследователями как средство доставки инструмента редактирования.



Лечение других метаболических заболеваний

«Ключом к нашему успеху стало использование системы, осуществляющей редактирование на уровне отдельных пар оснований», — объясняет докторант и главный автор исследования Лукас Виллигер. Система была разработана в Массачусетском технологическом институте и представлена в научных публикациях всего два года назад. До этого исследователи работали с традиционной системой CRISPR/Cas. В 2016 году Шванк и Виллигер начали использовать методы, разработанные американскими исследователями. «Даже с новыми редакторами на уровне оснований ДНК путь по-прежнему был нелёгким — нам пришлось экспериментировать», — говорит Виллигер. Самым большим сюрпризом стало то, что эта система оказалась намного эффективнее традиционной панели инструментов CRISPR/Cas.

Сейчас Шванк ищет финансирование для проведения исследований на других модельных животных, таких как свиньи. «Печень мыши отличается по размеру и структуре от печени человека или свиньи, поэтому, чтобы добиться прогресса, мы, несомненно, должны проводить исследования на других организмах».

Фенилкетонурия — не единственное генетическое нарушение метаболизма, которое поражает печень. Так, метаболические нарушения орнитинового цикла не позволяют организму удалять аммиак — побочный продукт обмена азотсодержащих веществ, — из крови и метаболизировать его до мочевины. Такие заболевания в основном проявляются нарушениями функций центральной нервной системы. Единственным доступным вариантом лечения при таких заболеваниях является пересадка печени. Поэтому Шванк хотел бы проверить возможности недавно разработанного инструмента редактирования генома для терапии таких заболеваний.


Источник:

Treatment of a metabolic liver disease by in vivo genome base editing in adult mice


Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl+Enter.