Human CRISPR

Человеческий аналог нацеленного на РНК белка Cas-13 может регулировать количество РНК и ее трансляцию.

Вопрос о том, как модификации РНК регулируют экспрессию генов, является одним из главных вопросов, исследуемых в лаборатории Брайана Дикинсона в университете Чикаго. На основе опытов, проведенных с использованием CRISPR-Cas13 для разработки некоторых модификаций, команда ученых выяснила две вещи. Во-первых, нацеливание на РНК имеет высокое клиническое значение в терапии. «Лечение носит временный характер,поскольку мы нацеливаемся на гены с временным контролем», — объясняет Дикинсон. Во-вторых, существуют трудности с системой, использующей большой бактериальный белок Cas13 для нацеливания на РНК. Дикинсон отмечает, что это затрудняет клонирование и доставку. К тому же при постоянном введении белка ускоряется образование антител.

Целью исследователей было заменить белок Cas13 человеческим аналогом. Аспирантка Симона Раух взялась за этот проект. Дикинсон отдает должное ее смелости и творческому подходу, поскольку многие сомневались, что это когда-нибудь сработает.

Для создания успешной системы нацеливания на РНК Симоне Раух были необходимы 4 компонента:
— одноцепочечная направляющая РНК, комплементарная РНК, используемой для нацеливания;
— белок, который связывается с направляющей РНК и стабилизирует ее;
— эффекторный белок, который будет вносить желаемые изменения;
— белок, который связывает все компоненты вместе.

Первая CIRT-система была представлена нуклеазным доменом человеческого фактора распада мРНК и снижала уровни мРНК и репортерного гена люциферазы, на который происходило нацеливание. Воодушевленные исследователи начали изменять различные части CIRTS. Они заменили нуклеазный эффектор на белок, «читающий» множественные модификации m6a на РНК в качестве нового компонента механизма трансляции, и другой «читающий» белок, вызывающий деградацию РНК. Как и ожидалось, уровни люциферазы повышались и понижались соответственно. При использовании аденозиндезаминазы в качестве эффектора команде удалось произвести редактирование A-to-l, которое превращало мертвую люциферазу со стоп-кодоном в рамке считывания в активный белок.

CIRTS также оказалась эффективна при нацеливании на эндогенные транскрипты. «Для меня удивительно, что это сработало так хорошо», — говорит Дикинсон. «Мы точно не знаем, как все взаимодействует при связывании с РНК. Мы отбирали и проверяли идеи. Как только мы получили первые CIRTS для работы, развивать эту тему стало гораздо проще».

Есть некоторые ограничения для любой нацеленной на РНК системы. Можно нацеливаться только на доступные сайты РНК, где возможно произвести вычислительные прогнозы. Дикинсон считает, что сайты, доступные для Cas13, будут также работать для CIRTS, что позволит изменять РНК. Другой вопрос, конечно, заключается в том, где необходимо нацелиться на эффектор для наилучшего достижения результата. Для каждой CIRTS Дикинсон представляет диаграмму сайтов Венна, по которой можно ориентироваться при нацеливании. Она показывает, где физически должен быть размещен эффектор. Дикинсон утверждает, что CIRTS поможет прояснить некоторые вопросы и покажет, какие различия характерны для данного эффектора, например, при нацеливании.

Дикинсон старается не переоценивать новый подход, поскольку результатов эксперимента в рамках человеческого организма еще нет и взаимодействия между белками могут оказаться проблематичными. Он видит это как первый этап на пути к цели. Сейчас, когда исследователи исходят не из микробного источника, технология может быть разработана на моделях доклинический клеточных культур, чтобы продемонстрировать эффективность, а у мышей — in vivo.

Также ученому нравится представлять большую картину того, как будет выглядеть мир после введения в использование CRISPR. Он предсказывает, что CRISPR будет успешна в применении для лечения моногенных болезней, однако для болезней, включающих несколько генов, потребуются новые подходы. Для Дикинсона одним из таких подходов к лечению заболевания является нацеленность на экспрессию генов на уровне РНК.