CRISPR: «Иммунная система» бактерий

…Планета Земля. Вокруг – необъятнейшие просторы воды, воздуха и почвы, кишащие твоими конкурентами: стоит тебе отличиться от соседа справа мутацией всего в одном важном гене, которая не даст тебе перерабатывать органику так же хорошо, как ему – и всё, твоя эволюционная гонка проиграна, манускрипт твоего генома забыт и вычеркнут из генофондной истории прокариот… Таков он – жесточайший антиутопический микромир, в котором живут, сосуществуют и беспрестанно конкурируют одноклеточные организмы, не имеющие ядра, размер которых составляет в среднем несколько микрометров (1 мкм = 10^-6 м). Среди не слишком богатого арсенала, которым располагают эти прокариоты для выживания, есть и своя защита от вирусов-интервентов (бактериофагов, или просто фагов). О ней мы и поговорим подробнее. Самое первое, что следует про неё сказать – это то, что она представляет собой прекрасный пример настоящего «ламарковского» наследования приобретённых признаков, то есть она передаётся по наследству при размножении клетки. Таким образом, однажды встретившись с каким-то вирусом, очень многие микробы способны «запомнить» его в виде последовательностей фаговой ДНК, вставив их в свой же геном, и эта «память» будет ещё некоторое время передаваться потомкам. Получается что-то наподобие фоторобота: если другой такой же (или немного отличающийся) вирус в будущем атакует бактерию, то он тут же получит мощный отпор со стороны клетки. При обычном заражении дело идёт так, что вирус впрыскивает свою ДНК или РНК и далее с них считывается необходимая информация и синтезируются нужные белки, причём для сего действия «заимствуются» ферменты и структуры самой клетки. Интересно, что у эукариот – животных, растений и грибов – есть довольно похожий механизм с гораздо более разнообразными функциями, РНК-интерференция. Такая система адаптивного иммунитета называется CRISPR/Cas (с англ. Короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами / CRISPR-ассоциированные белки). Она представлена семейством ДНК-повторов, найденных в большинстве архейных (~90%) и бактериальных (~40%) геномов . Изначально открытие структуры CRISPR было сделано случайно у Escherichia coli в 1987 г., но акроним был придуман в 2002-м, после этого схожие структуры были замечены в геномах многих Бактерий и Архей . Типичные локусы CRISPR состоят из нескольких несмежных прямых повторов, разделённых участками вариабельных последовательностей – спейсерами. Эти спейсеры (с англ. space – не только «космос», но и «пространство») представляют собой сегменты захваченных вирусных и плазмидных последовательностей и имеют высокую скорость эволюции для обоих cas-генов . cas-гены кодируют огромное и неоднородное семейство белков, которые несут функциональные домены типичных нуклеаз (ферменты, разрезающие ДНК), хеликаз (ферменты, расплетающие обе цепи ДНК), полимераз (ферменты, которые наращивают цепь ДНК при её удвоении) и ДНК-связывающих белков. Это означает, что белки, которые кодируются упомянутыми cas-генами, способны выполнять функции всех вышеперечисленных ферментов. Многие повторы частично палиндромны (т.е. читаются одинаково в обоих направлениях) и благодаря этому имеют возможность формировать стабильные, высококонсервативные вторичные структуры в виде «шпилек»: Размер CRISPR-повтора составляет 23–47 пар оснований, а спейсеров — от 21 до 72 пар. Число групп «повтор/спейсер» может достигать 375, но обычно меньше 50 . Микробы могут содержать больше одного локуса CRISPR (по идее один локус направлен на защиту от одного вируса); до 18 локусов было идентифицировано у архей Methanocaldococcus jannaschii, составляющих аж больше 1% генома . Обычно CRISPR находятся в бактериальной хромосоме, но могут быть идентифицированы и в плазмидной ДНК . Для объяснения такой изменчивости спейсеров CRISPR выдвигалось несколько предположений: -активация экспрессии соседних генов; -мишень для ДНК-связывающих белков; -разделение репликонов; -«ремонтирование» (репарация) ДНК и др. . В 2005 г. три независимых исследования выявили гомологию (общность происхождения) между спейсерной последовательностью и внехромосомными элементами, такими как вирусы и плазмиды. Это и привело к предположению, что CRISPR может обеспечивать адаптивный иммунитет против чужеродных генетических элементов. Кроме этого, данный механизм, как несложно догадаться, действует ещё и как ограничитель горизонтального переноса генетической информации (т.е. от бактерии к бактерии; такой перенос, к примеру, объясняет стремительное развитие устойчивости ко многим антибиотикам). Ну и, наконец, отмечено, что система CRISPR может активно участвовать в регуляции «своих» бактериальных генов (а также последовательностей профагов и транспозонов внутри генома – это такие некогда встроившиеся в ДНК вирусы-паразиты), в частности, при взаимодействии бактерий с организмом-эукариотом, в котором они паразитируют. Так, например, бактерия может подавлять выработку у себя некоторых антигенов, и это помогает ослабить иммунный ответ со стороны хозяина . Структуру типичных CRISPR и весь этот механизм защиты можно представить такой схемой (далее будем опираться на неё): Итак, мы выяснили, что в этой замечательной системе задействованы два партнёра, которые действуют сообща: генетические локусы CRISPR, содержащие элементы геномов некогда заражавших бактерию вирусов (пассивный), и семейство Cas-белков, которые используют эти локусы собственно для реализации защиты (активный). Сами локусы CRISPR – это не что иное, как чередование коротких палиндромных повторов и спейсеров. А теперь разберём, что же тут на самом деле происходит. Некоторые Cas-белки вовлечены в формирование новых спейсеров, другие обеспечивают CRISPR-зашифрованное сопротивление фагам и вступают в противостояние (интерферируют) с инвазивными генетическими элементами. Несмотря на то что сама защита закодирована в спейсерах, информация, которая лежит внутри CRISPR-кассет и пары «повтор/спейсер» становятся доступными для белков Cas только после транскрипции (перевода последовательности ДНК в РНК). Итак, разделим механизм действия на две фазы: «иммунизация» и «ответ». Начнём с первой. Представим, как множество бактериофагов садится на поверхность бактериальной клетки. Это выглядит примерно вот так: Допустим, один из них впрыснул свою ДНК внутрь. Сегодня фагу не повезло: клетка уже познакомилась с таким же вирусом ранее. В тот раз с кусочками фаговой ДНК связался один из белков системы Cas и после их расщепления сформировал из них новые спейсеры, которые встроились в бактериальную ДНК между повторами и остались там до сего дня. При этом оказывается, что спейсер комплементарен своему прото-спейсеру на вирусном геноме. Принципиально важно (и это не даёт системе случайно атаковать собственную ДНК), что протоспейсеры фланкированы с обеих сторон короткой (2-5 п.н.) консервативной последовательностью, называемой РАМ (Protospacer Adjacent Motif; мотив, прилежащий к протоспейсеру) . Новый спейсер всегда встраивается со стороны АТ-богатой лидерной последовательности (связи А—Т слабее связей Г—Ц и поэтому в этом месте раскрутить ДНК и считать с неё информацию термодинамически легче), находящейся перед CRISPR-кассетой (см. картинку), в ней же находятся промоторные элементы и сайты посадки регуляторных белков . Возвращаемся к «сегодняшнему» фагу. Для того, чтобы обезвредить его генетическую информацию, чтобы вирус не смог размножиться в клетке, нужно ещё очень постараться. И вот как это достигается. С локусов CRISPR происходит транскрипция ДНК – теперь все спейсеры представлены в виде одной длинной пре-crРНК (полиспейсерный предшественник CRISPR-РНК), которая разделяется на части в ходе процессинга (удаление повторов между ними, осуществляет эндонуклеаза Cas6), причём благодаря палиндромной структуре повторов сделать это довольно просто, так как в одноцепочечной РНК они представляют собой «шпильки» (картинка №1) – вот и вообразите, что такие вот «шпильки» висят между спейсерами. Удалить их – не проблема. Далее в игру вступают белки Cas. Они связывают эти РНК-спейсеры, которые теперь называются crРНК (т.е. CRISPR-РНК), и используют последние в качестве матрицы. Эта матрица для Cas-белков – что-то в роде распечатки фоторобота нежелательного вируса: фиксируя эту распечатку одним участком (доменом) своей белковой молекулы, другим доменом они взаимодействуют с попавшими в клетку чужеродными кусочками ДНК и сравнивают обе картинки: если crРНК полностью комплементарны этим связанным фрагментам, то Cas-белки тут же разрежут эти кусочки на ещё более мелкие и дадут клетке понять, что её атакуют внешние агенты (эта стадия имеет своё название – CRISPR-интерференция). Cas-белки используют сrRNA (красные цепи) как матрицу   Очень длительная параллельная эволюция вирусов и их хозяев привела к появлению у вирусов защитных механизмов против CRISPR-интерференции, и это объясняет большое разнообразие CRISPR/Cas-систем у бактерий и архей. Анализом всего этого разнообразия занимаются биоинформатики . Переходим ко второй части повествования – о корыстном применении этого бактериального механизма нами, человеческими особями. Во-первых, зная, что эта система существует, можно фактически вычислить все чужеродные генетические элементы, на которые микроб и его предки составили «фоторобот» (спейсер) и засунули в свой архив (встроили в свою ДНК). В частности, это может быть полезно для получения информации о микробиоме (совокупности микроорганизмов, населяющих тело) человека. Ведь интересно то, что общее число клеток микробов, которые проживают в нас, больше наших собственных по меньшей мере в 10 раз! И не удивительно, что в 2007 году даже был запущен большой международный «the human microbiome project» (HMP). Для изучения такого объёма данных применяются методы метагеномики. Итак, исследование CRISPR-систем в микробиоме человека позволит восстановить историю недавних фаговых заражений основных бактерий микробиома . Ну и, во-вторых, можно приватизировать эту машинку для генетических исследований и даже генно-клеточной терапии, используя CRISPR/Cas-систему для редактирования генома. По этой части существует ещё один механизм, который стал использоваться на два года раньше CRISPR, то есть в 2011 г. – «TALEN» (Transcription Activator-Like Effector Nucleases; эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции) . Биоинформатики классифицируют CRISPR/Cas-системы на три основных типа, среди них в геномной инженерии чаще всего используется система типа II-A, которая была подсмотрена и выделена у S. pyogenes. Судите сами: набор cas-генов у неё минимален, а один-единственный многофункциональный белок-универсал Cas9 осуществляет и процессинг пре-crРНК, и интерференцию чужеродной ДНК. Это оказалось жутко удобным и учёные решили, что просто грех этим не воспользоваться. А использовать эту технологию можно для двух великих целей: или какой-то ген «выключить» (на генетическом слэнге – «нокаутировать»), или, наоборот, «включить»: Из чего же состоит общая стратегия редактирования генома с помощью сайт-специфических нуклеаз (ферментов, разрезающих ДНК в определённых участках)? Она включает четыре основных этапа:

• Выбор целевой нуклеотидной последовательности в геноме;
• Создание нуклеазной конструкции, направленной на выбранную мишень;
• Доставка этой конструкции в клеточное ядро;
• Анализ полученных мутаций .

Один из самых тяжёлых этапов – это выбор сайтов (точек в геноме) для специфичного внесения двухцепочечного разрыва. Здесь следует избегать повторяющихся сайтов (чтобы разрезать ДНК только в определённом месте), а также участков, которые имеют высокую гомологию с другими районами генома и потому сильно похожих на целевой сайт. Известно, что нуклеаза Cas9 реагирует на присутствие РАМ с мотивом 5'-NGG-3' (где N – любой из 4 нуклеотидов). То, что этот косенсус такой короткий, является с одной стороны преимуществом (его можно использовать для большого количества генов), а с другой – недостатком, так как сравнительно высока вероятность нецелевых мутаций (а двухцепочечные разрывы, надо сказать – наиболее тяжкое повреждение для ДНК, так как одноцепочечные хотя бы можно склеить по комплементарным основаниям). В этом отношении, например, CRISPR/Cas типа II бактерии N. meningitidis распознает PAM с консенсусом 5'-NNNNGATT-3', что, безусловно, ограничивает возможности в выборе мишени, однако может повысить специфичность и снизить вероятность нецелевых мутаций. Разумеется, поиску нужных сайтов также помогает биоинформатика. Показано, что для разрезания ДНК in vitro и в бактериальных клетках с использованием CRISPR/Cas9 необходимы и достаточны следующие компоненты:

• пре-crРНК и некодирующие РНК tracrRNA (это такие помощники для первых);
• РНКаза III;
• белок Cas9.

Использование этой системы в клетках млекопитающих имеет ряд особенностей – так, например, РНКаза III не нужна, потому что с процессингом crРНК неплохо справляются и собственные клеточные РНКазы . Вот так примерно выглядит генетическая конструкция для редактирования генома эукариот: Схема генетической конструкции, экспрессирующей элементы системы CRISPR/Cas. hCas9 – последовательность белка Cas9, оптимизированная для экспрессии в клетках эукариот. sgRNA – единая химерная РНК, содержащая части crRNA и tracrRNA, необходимые для функционирования. NLS – сигнал ядерной локализации, который обеспечивает попадание конструкций в ядро. Поли(А) – сигнал полиаденилирования Для того, чтобы всю эту махину доставить в культивируемые in vitro клетки, обычно используют плазмидные векторы (о том, что они собой представляют и как именно их можно загнать внутрь, можно почитать в другой моей статье о генной терапии). :Один из генов риса (справа) нокаутирован методом CRISPR, из-за чего проростки превратились в карликовых альбиносов Наконец, нельзя не упомянуть о том, какой потенциал этот механизм несёт для нашей медицины. George Church из Гарвардского университета, чья лаборатория была одной из первых, продемонстрировавших работоспособность системы на человеческих клетках, вместе со своей командой синтезировал целую библиотеку из десятков тысяч РНК-последовательностей, которые могут быть нацелены на 90% человеческих генов . «Вы можете закидать геном любыми вообразимыми CRISPR», – говорит Church. Например, система уже активно используется для модификации плюрипотентных стволовых клеток и коррекции их генетического материала с последующим введением исправленных клеток в кровь человека (iPSC – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки): Или, к примеру, технология может помочь в поиске мишеней для противораковых препаратов – уже был проведён скрининг около 200 потенциальных мишеней в лейкозных клетках . Таким образом, CRISPR/Cas-система оказалась очень удобной и эффективной для использования. С CRISPR учёные могут создавать мышиные модели человеческих заболеваний гораздо скорее, нежели раньше, изучать индивидуальные гены быстрее и запросто менять сложные гены в клетках лишь однажды для исследования их взаимодействий. Пионеры в этой области уже формируют компании для использования технологии в целях лечения генетических заболеваний. «Я не думаю, что есть другой пример в любой иной области, которая двигалась бы так же быстро», – считает Blake Wiedenheft, биохимик университета штата Монтана.   Автор: Азат Муртазин Перевод картинок: Teddy Picker   Список литературы:

1. 1  Philippe Horvath and Rodolphe Barrangou. CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea. Science 327, 167 (2010)
2. R. Jansen, J. D. Embden, W. Gaastra, L. M. Schouls, Mol. Microbiol. 43, 1565 (2002).
3. S. Makarova et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 2011 June ; 9(6): 467–477
4. R. K. Lillestøl, P. Redder, R. A. Garrett, K. Brügger, Archaea 2, 59 (2006).
5. J. S. Godde, A. Bickerton, J. Mol. Evol. 62, 718 (2006).
6. K. S. Makarova, L. Aravind, N. V. Grishin, I. B. Rogozin, E. V. Koonin, Nucleic Acids Res. 30, 482 (2002).
7. Sampson TR, Saroj SD, Llewellyn AC, Tzeng YL, Weiss DS. A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence. Nature; 497(7448) (2013), 254—257
8. Mojica F.J., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., Almendros C. Microbiology. 2009. V. 155. P. 733–740.
9. Hale C.R., Majumdar S., Elmore J., Pfister N., Compton M., Olson S., Resch A.M., Glover C.V., Graveley B.R., Tern R.M. Mol. Cell. 2012. V. 45. № 3. P. 292–302.
10. Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П., Закиян С.М. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas – инструменты открытий. Acta naturae | Том 6 № 3 (22) 2014 С. 20-42
11. Гоглева А.А., Артамонова И.И. CRISPR-системы прокариотического иммунитета в микробиоме человека. http://old.itas2011.iitp.ru/pdf/1569459275.pdf
12. Elizabeth Pennisi. The CRISPR Craze. SCIENCE. Vol 341 23 August 2013. P. 833-836
13. Васильева Е.А., Мелино Д., Барлев Н.А. Применение системы направленного геномного редактирования CRISPR/Cas к плюрипотентным стволовым клеткам. Цитология (2015), том 57, №1. С. 19-30
14. Junwei Shi, Eric Wang, Joseph P Milazzo, Zihua Wang, Justin B Kinney, Christopher R Vakoc. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology, 2015