Подготовлено членами Биомедицинского Клуба Сеченовского Университета

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является одной из ведущих причин смерти по всему миру. Инфаркт миокарда — основное проявление ИБС, приводящее к отмиранию части кардиомиоцитов и последующему их замещению соединительной тканью. В результате формируется рубец; такая ткань в составе сердца не способна участвовать в выполнении его основной функции — сокращения, что приводит к сердечной недостаточности. 

Для профилактики остановок сердца и других неблагоприятных последствий ИБС было разработано множество различных подходов: пересадка сердца, искусственные аппараты, а также трансплантация кардиомиоцитов, чаще всего полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК).

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК)

Индуцированные плюрипотентные клетки кардинально изменили область регенеративной биомедицины, однако в отношении предшественников кардиомиоцитов на данное время остается немало нерешенных вопросов. Одна из таких проблем заключается в том, что индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты остаются незрелыми в сравнении в кардиомиоцитами взрослого человека. Данный факт ограничивает использование культур кардиомиоцитов (например, в фармакологических исследованиях).

Кардиомиоциты, полученные из ИПСК, во многом похожи на первичные кардиомиоциты: они имеют схожий набор ионных каналов, структуру саркомеров, характерные всплески концентрации ионов кальция. Однако их применение ограничено ввиду незрелого фетального фенотипа — они имеют недостаточно структурированные миофибриллы, меньший размер клетки, отличные от присущих зрелым кардиомиоцитам электрические свойства и силу сокращения. Фетальные кардиомиоциты имеют округлую форму, в то время как зрелые — удлиненную или палочковидную.

Для преодоления этих проблем был разработан ряд лабораторных методов [1].

1. Долгосрочные культуры

Через 80–120 дней культивирования показаны критические изменения фенотипа фетальных кардиомиоцитов по сравнению с кардиомиоцитами, культивированными в течение 20–40 дней. Такие клетки увеличиваются в размерах, становятся более поляризованными, миофибриллы уплотняются, и саркомеры становятся более структурированными. Также значительно увеличивается фракция многоядерных кардиомиоцитов. Помимо этого, отмечают другой, более зрелый, характер сокращения и кальциевых колебаний в таких клетках. Данные изменения связывают с экспрессией ключевых кардиомиоцитарных маркеров — тяжелых цепей β-миозина и коннексина-43 [2].

2. Жесткие субстраты

Увеличение жесткости субстрата обычно позволяет кардиомиоцитам приобрести более зрелый фенотип. Это связано с тем, что во время эмбрионального развития базальные мембраны и внеклеточный матрикс претерпевают изменения и накапливают больше коллагена. Таким образом, добавление к подложке культивируемых кардиомиоцитов различных жестких субстратов повторяет условия созревания этих клеток in vivo. Кроме того, механически напряженный субстрат (например, из фибрилл коллагена) облегчает ориентировку кардиомиоцитов в пространстве — в результате они вытягиваются вдоль волокон, что ведет и к другим физиологическим изменениям [3].

3. Электрическая стимуляция

В определенный момент эмбрионального развития кардиомиоциты начинают сокращаться. Электрические стимулы соседних клеток помогают кардиомиоцитам синхронизироваться, чтобы полноценно выполнять функции сердца. В условиях клеточных культур невозможно воспроизвести все процессы, происходящие в эмбрионе, и точные механизмы спонтанного возникновения сокращений до сих пор неизвестны. Внешняя электростимуляция имитирует стимулы от соседних клеток, уже начавших сокращаться, и поэтому позволяет запустить завершающие стадии созревания кардиомиоцитов [4].

4. Сигнальные молекулы. Гормоны

Известно, что решающую роль в развитии сердечно-сосудистой ткани играют гормоны щитовидной железы. Их влияние в своей работе продемонстрировали Янг c соавт. [11]. Было показано, что обработка индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов трийодтиронином изменяет морфологию клеток — они становятся более крупными и удлиненными с большей длиной саркомеров. Также повысилась митохондриальная активность и усилился уровень высвобождения и захвата кальция в кардиомиоцитах, что способствовало усилению сократительной активности клеток. Замечено, что добавление аналога глюкокортикостероида — дексаметазона — к культуре кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, усиливает их созревание [12].

5. Сокультивирование с другими типами клеток

Подобно прочим ведущим клеточным элементам тканей и органов, кардиомиоциты составляют далеко не всю массу сердца. Помимо них в сердце присутствует большое число фибробластов, эндотелиальных клеток и т.д. Чтобы получить условия, наиболее близкие к физиологическим, необходимо воссоздать все компоненты микроокружения клеток сердечно-сосудистой системы. В многочисленных исследованиях было показано, что микроокружение и ниша стволовой клетки играет определяющую роль в ее судьбе. Это справедливо и для незрелых кардиомиоцитов. Поэтому добавление даже 1–2 типов клеток к культуре кардиомиоцитов позволяет добиться более быстрого и полного созревания [5].

В исследовании Абекасиса с соавт. индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты культивировали совместно с мезенхимными стволовыми клетками (МСК) и эндотелиальными клетками [8]. МСК секретируют во внеклеточное пространство ряд факторов для обеспечения дифференцировки и связи с ИПСК, а эндотелиальные клетки экспрессируют компоненты внеклеточного матрикса, взаимодействие с которыми способствует увеличению длины саркомеров. Благодаря этим молекулам совместное культивирование с МСК и эндотелиоцитами усиливает созревание индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов.

6. Переключение клеточного источника энергии

В незрелом состоянии клетки используют в качестве источника энергии аэробный гликолиз вместо наиболее эффективного митохондриального окислительного фосфорилирования. У ученых возникла гипотеза, что переключение незрелого пути получения АТФ на зрелый способствует созреванию кардиомиоцитов, а также изменяет их физико-химические свойства, адаптируя к внешним условиям.

Переключить путь метаболизма возможно с помощью белка PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha). В исследовании Лиу с соавт. [10] было показано, что активатор ZLN005 усиливает экспрессию PGC-1α, тем самым индуцируя характерный для зрелых клеток энергетический обмен, что вызывает созревание кардиомиоцитов. Такие кардиомиоциты являются наиболее идентичными естественным кардиомиоцитам человека. 

Более простым способом является переключение метаболизма с гликолиза на окисление жирных кислот [9], что тоже достоверно способствует созреванию кардиомиоцитов. Для этого глюкозу в культуре клеток заменяют на галактозу и жирные кислоты — в частности пальмитиновую, олеиновую, линоленовую кислоты и карнитин.

7. 3D-культивирование

Для трехмерного культивирования кардиомиоцитов чаще всего используют гидрогели. Гидрогели позволяют смоделировать нативные условия для данного типа клеток за счет имитации трехмерного внеклеточного матрикса. Для сердечной тканевой инженерии используется широкий спектр синтетических и натуральных гидрогелей: матригель, фибрин, альгинат, желатин, коллаген, полиэтиленгликоль и многие другие. Чаще всего гидрогели комбинируют с другими подходами для более эффективной стимуляции созревания кардиомиоцитов [6, 7].

Источники:

1. Jiang Y, Park P, Hong SM, Ban K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Vol. 41, Molecules and Cells. Korean Society for Molecular and Cellular Biology; 2018. p. 613–21. 
2. Lundy SD, Zhu WZ, Regnier M, Laflamme MA. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev [Internet]. 2013 Jul 15 [cited 2020 May 28];22(14):1991–2002. Available from: https://www.liebertpub.com/doi...
3. Jacot JG, McCulloch AD, Omens JH. Substrate stiffness affects the functional maturation of neonatal rat ventricular myocytes. Biophys J [Internet]. 2008 Oct 1 [cited 2020 May 28];95(7):3479–87. Available from: https://linkinghub.elsevier.co...
4. Nunes SS, Miklas JW, Liu J, Aschar-Sobbi R, Xiao Y, Zhang B, et al. Biowire: A platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods [Internet]. 2013 Aug 23 [cited 2020 May 28];10(8):781–7. Available from: http://www.nature.com/articles...
5. Shadrin IY, Allen BW, Qian Y, Jackman CP, Carlson AL, Juhas ME, et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat Commun [Internet]. 2017 Dec 1 [cited 2020 May 28];8(1):1825. Available from: http://www.nature.com/articles...
6. Camci-Unal G, Annabi N, Dokmeci MR, Liao R, Khademhosseini A. Hydrogels for cardiac tissue engineering [Internet]. Vol. 6, NPG Asia Materials. Nature Publishing Group; 2014 [cited 2020 May 28]. p. e99–e99. Available from: http://www.nature.com/articles...
7. Hirt MN, Hansen A, Eschenhagen T. Cardiac tissue engineering : State of the art [Internet]. Vol. 114, Circulation Research. Lippincott Williams and Wilkins; 2014 [cited 2020 May 28]. p. 354–67. Available from: https://www.ahajournals.org/do...
8. Ahmed RE, Anzai T, Chanthra N and Uosaki H (2020) A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Front. Cell Dev. Biol. 8:178. doi: 10.3389/fcell.2020.00178
9. Yang, X., Rodriguez, M. L., Leonard, A., Sun, L., Fischer, K. A., Wang, Y., et al. (2019). Fatty acids enhance the maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 13, 657–668. doi: 10.1016/j.stemcr. 2019.08.013
10. Liu et al. PGC-1α activator ZLN005 promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. AGING 2020. 12, № 8, 7411-7430.
11. Yang, X., Rodriguez, M., Pabon, L., Fischer, K. A., Reinecke, H., Regnier, M., et al. (2014b). Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J. Mol. Cell Cardiol. 72, 296–304. doi: 10.1016/j.yjmcc.2014.04.005.
12. 12. Parikh, S. S., Blackwell, D. J., Gomez-Hurtado, N., Frisk, M., Wang, L., Kim, K., et al. (2017). Thyroid and glucocorticoid hormones promote functional T-tubule development in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ. Res. 121, 1323–1330. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.117.311920